Caratterizzazione del profilo metabolico e trascrizionale di una popolazione di Vitis spp. segregante per la resistenza a Plasmopara viticola

La maggior parte delle varietà di Vitis vinifera oggi coltivate è stata generata dall’incrocio non controllato tra viti addomesticate e viti selvatiche e tale processo è stato accompagnato da una graduale perdita dei tratti di resistenza ai patogeni portati dalla vite selvatica. Tra gli agenti causali di malattie che colpiscono foglie e grappoli della vite coltivata, uno dei principali è costituito da Plasmopara viticola, fungo biotrofico appartenente all’ordine degli oomiceti. L’obiettivo principale di questo progetto di dottorato è stato quello di approfondire, mediante lo studio della modulazione dei profili trascrizionali e metabolici, i meccanismi alla base del processo di resistenza della vite a P. viticola, per identificare geni e metaboliti coinvolti in tale processo. Lo studio è stato condotto su alcuni individui di una popolazione F1 segregante per il tratto di resistenza a P. viticola e derivante dall’incrocio tra Freiburg 993-60 (ibrido complesso di V. vinifera, V. rupestris e V. lincecumii) e la cultivar di V. vinifera ‘Teroldego’. L’obiettivo è stato perseguito tramite l’impiego di tecniche di caratterizzazione trascrizionale e metabolica su ampia scala, quali AFLP-TP e “microarray” da un lato ed HPLC-DAD-MS dall’altro. Inizialmente è stata eseguita una caratterizzazione della risposta al fungo nella popolazione d’incrocio, a distanza di 10 giorni dall’infezione fungina, che ha evidenziato una variabilità di risposta genotipo-dipendente ed ha permesso di assegnare gli individui a classi fenotipiche con diverso grado di resistenza. L’analisi HPLC-DAD-MS, condotta parallelamente sugli stessi campioni, ha portato a tre risultati principali: ha confermato l’accumulo di stilbeni in seguito all’infezione fungina, ha evidenziato individui “alto”, “basso” e “non-produttori” di trans–resveratrolo ed ha identificato oligostilbeni e stilbenoidi non ancora isolati e caratterizzati in specie di vite. In particolare la concentrazione di trans-resveratrolo delle foglie infettate è risultata correlata in maniera significativa con il fenotipo della resistenza, come già riportato in altri studi. Gli esperimenti di AFLP-TP, condotti a partire da RNA estratto dalle foglie dell’individuo F1 21/66 e del parentale Freiburg 993-60, hanno permesso di monitorare i cambiamenti trascrizionali che avvengono a 12, 24, 48 e 96 ore dall’inoculo fungino. L’individuo F1 21/66 era risultato totalmente resistente al fungo e “alto produttore” di trans-resveratrolo, mentre Freiburg era risultato parzialmente resistente e “non produttore” di trans-resveratrolo. Mediante AFLP-TP sono stati isolati ed identificati 458 trascritti differenzialmente espressi rispetto ai controlli non trattati e la maggior parte di essi è risultata modulata nell’individuo totalmente resistente. La successiva costruzione di “oligo-array” a tecnologia Combimatrix, a partire dalle 458 sequenze ottenute nell’analisi AFLP-TP, ha permesso di estendere rapidamente l’analisi di espressione genica al parentale ‘Teroldego’ e all’individuo F1 22/73, entrambi suscettibili al fungo e di ripetere l’analisi sull’individuo resistente F1 21/66. L’analisi trascrizionale è stata effettuata a 12 e 96 ore dall’infezione con P. viticola, che si sono rivelati i tempi con maggior modulazione nell’analisi AFLP-TP. L’analisi statistica dei dati di ibridazione relativi ai 3 individui ha permesso di identificare un set di geni differenzialmente espressi in uno o in entrambi i tempi analizzati. In particolare il confronto tra controllo e trattati per ciascun individuo ha evidenziato 159 geni modulati significativamente nell’individuo resistente F1 21/66 e 103 nel parentale suscettibile ‘Teroldego’. In entrambi, la maggior parte di questi geni è risultato indotto, mentre nell’individuo suscettibile F1 22/73 circa metà dei 114 geni significativamente modulati è risultato represso. Per evidenziare ulteriori differenze fra gli individui sottoposti allo studio trascrizionale, le sequenze dei geni modulati sono state annotate con il vocabolario gerarchico Gene Ontology (GO). Nell’individuo resistente (F1 21/66) è emersa la modulazione di geni codificanti proteine coinvolte sia negli eventi precoci, quali regolazione di flussi ionici e cascata di fosforilazione, successivi al riconoscimento del patogeno, sia in quelli tardivi quali sintesi di lignina, proantocianidine e stilbeni e degradazione di parete, che portano al contenimento ed alla morte del patogeno stesso. Negli individui suscettibili invece l’inibizione di geni codificanti chitinasi ed osmotine, enzimi di sintesi dei fenilpropanoidi e proteine dell’apparato fotosintetico è in buon accordo con il fenotipo osservato, con l’incapacità di frenare la diffusione del patogeno e con la perdita delle funzionalità fotosintetiche ed il conseguente sviluppo di clorosi.

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