Nuovi approcci proteomici per l'identificazione di potenziali marcatori di neoplasie pancreatiche

Lo sviluppo di approcci rapidi ed automatizzati come la tecnologia multidimensionale di identificazione proteica (MudPIT) sta rendendo la proteomica uno strumento sempre più efficiente per l’analisi delle proteine in miscele complesse, permettendo l’identificazione di nuovi marcatori biologici che sono di importanza critica per una migliore comprensione della biologia dei tumori e per rendere la sua rilevazione più precoce e meno invasiva. Lo scopo del presente studio era quello di identificare nuove proteine rilasciate dalle cellule di adenocarcinoma duttale del pancreas, usando piccole quantità di campione ed un sistema automatizzato; le evidenze sperimentali così ottenute sarebbero state utilizzate per verificare in vitro ed in vivo, con metodiche più tradizionali quali western blot, RT-PCR ed immunoistochimica, la presenza delle proteine selezionate come possibili marcatori. È stata dunque applicata la tecnologia MudPIT, che incorpora la cromatografia capillare bidimensionale e la spettrometria di massa in tandem, per l’analisi di piccole quantità di surnatanti privi di siero derivanti dalla coltura di cellule Suit-2 non trattate oppure attivate con esteri del forbolo e ionoforo. I potenziali marcatori prescelti sono stati valutati in altre linee cellulari di cancro del pancreas, adenocarcinomi primitivi e xenotrapiantati in topi nu/nu. L’analisi MudPIT effettuata su campioni di 10 μl di surnatanti ha permesso l’identificazione complessiva di 46 proteine tra cellule attivate e non trattate. Di queste proteine, 21 sono classificate come secrete sui database pubblicamente disponibili e 10 non erano state precedentemente associate al carcinoma duttale del pancreas. Questo gruppo comprende le proteine CSPG2/versican, Mac25/angiomodulina, IGFBP-1, HSPG2/perlecan, syndecan 4, FAM3C, APLP2, ciclofilina B, K2 microglobulina, ed ICA69. Le evidenze sperimentali che queste proteine siano rilasciate dalle cellule tumorali in vivo sono state ottenute, per CSPG2/versican e Mac25/angiomodulina, mediante immunoistochimica. L’analisi è stata eseguita tanto su tumori primitivi quanto su di un modello, consistente in cellule della linea Suit-2 incluse in una matrice amorfa (Matrigel®) e trapiantate per una settimana in topi atimici. Si è inoltre dimostrato, mediante il confronto tra cellule non trattate ed attivate con esteri del forbolo, che l’analisi MudPIT può fornire dati semiquantitativi correlati con la quantità relativa di proteina presente nel campione analizzato; anche quest’osservazione è stata convalidata mediante misurazione del diverso livello di espressione di tre proteine rispettivamente inibite (Mac25/angiomodulina), non modificate (CSPG2/versican) ed indotte (MMP-1). Si è poi indagata, su una casistica di 100 pazienti con varie patologie pancreatiche, l’espressione di forme solubili di uPAR (suPAR), il cui ligando uPA era tra le proteine maggiormente indotte in seguito all’attivazione delle cellule in vitro. L’analisi è stata fatta utilizzando una metodica immunoenzimatica (saggio ELISA) su sieri ed urine dei casi disponibili presso la biobanca della clinica chirurgica dell’Università di Verona. E’ stato riscontrato un significativo incremento dei valori di suPAR nei sieri di pazienti affetti da adenocarcinoma duttale del pancreas rispetto alle altre patologie infiammatorie o neoplastiche del pancreas; i dati delle urine, pur se meno netti, indicano comunque una tendenza simile ed incoraggiano ad un incremento del numero di campioni sui quali effettuare ulteriori analisi. Confrontato con altre metodiche, dunque, MudPIT è stato in grado di fornire in modo rapido e riproducibile dati su di una serie di molecole rilasciate da cellule neoplastiche, che hanno quindi caratteristiche di sicuro interesse quali potenziali marcatori di malattia potenzialmente rilevabili nei liquidi biologici. Gli sviluppi futuri di tale approccio comprendono, oltre all’ampliamento dell’analisi MudPIT su un numero maggiore di linee cellulari, lo sviluppo di nuovi reagenti per l’identificazione quelle molecole per le quali essi non sono attualmente disponibili.

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