Transient dimerization in the early secretory pathway characterizes the FGF-Receptors biosynthesis

I recettori per i fattori di crescita dei fibroblasti (FGFR) presentano attività tirosino chinasica (TK) e vengono processati attraverso differenti fasi di maturazione/glicosilazione che avvengono nei compartimenti cellulari della via di secrezione. In questo studio abbiamo determinato due nuovi eventi che caratterizzano la biosintesi dell’FGFR3. Innanzitutto, dimostriamo che una limitata frazione del recettore selvaggio immaturo, ricco in mannosi, è sottoposta a dimerizzazione transeunte nelle fasi precoci della via secretoria. Diversamente, le forme glicosilate mature, proseguono verso la superficie cellulare come monomeri. L’efficienza di dimerizzazione del recettore è aumentata dall’attività chinasica costitutiva associata alla mutazione K650E del FGFR3, ritenuto nel reticolo endoplasmico (ER) e responsabile della displasia tanatoforica di tipo II (TDII). Dimostriamo, infatti che l’abrogazione di tale attività chinasica riporta l’efficienza di dimerizzazione ai livelli basali osservati per il recettore selvaggio. Dimostriamo, inoltre, che il mutante K650E dimerizza e trans-fosforila l’FGFR3 selvaggio nella sua forma immatura supportando l’ipotesi che la dimerizzazione tra il recettore mutato e quello selvaggio comporti il sequestro di quest’ ultimo nel ER. Tale evento potrebbe spiegare il carattere genetico “dominante” dell’allele K650E nella TDII. Per mezzo della tecnica di “complementazione dei frammenti proteici basata sulla ricostituzione della fluorescenza” confermiamo la dimerizzazione del FGFR3 in vivo. Mostriamo inoltre che l’FGFR3 è una proteina cargo per la lectina mannosio-specifica ERGIC-53. Nell’insieme questi dati evidenziano che la dimerizzazione transeunte è un evento nella biosintesi dell’FGFR3 ed ipotizziamo possa fare parte di un meccanismo di “controllo qualità” di preassemblaggio del recettore, dal momento che l’attivazione funzionale del FGFR3 avviene sotto forma dimerica ed è conseguente all’interazione con il ligando specifico FGF, sulla superficie cellulare. Mostriamo inoltre, per la prima volta la presenza di complessi ERGIC-53/FGFR3 suggerendo un ruolo per ERGIC53 nel trasporto di FGFR3 dal ER al Golgi. Osserviamo infine che anche l’FGFR2, un altro membro della famiglia degli FGFR, presenta un livello ‘basale’ di dimerizzazione delle forme immature ricche in mannosio, suggerendo che tale dimerizzazione intracellulare possa essere un meccanismo comune a tutti i membri della famiglia degli FGFRs.

The tyrosine kinase Fibroblast Growth Factor Receptors (FGFRs) are processed though different stages of maturation/glycosylation occurring in the various compartments of the secretory pathway. In this study, we have determined a novel event that characterizes the biosynthesis of FGFR3. We show that a limited fraction of the immature mannose-rich wild-type receptor undergoes transient dimerization in the early phase of the secretory pathway. The mature FGFR3 glycomers however, pursues the cell surface as monomers. The constitutive kinase activity associated to the K650E FGFR3 mutant that is retained in the endoplasmic reticulum (ER), increases dimerization efficiency and accordingly, abrogation of the kinase activity restores the “basal” dimerization level observed for the wild-type FGFR3. Furthermore, the K650E mutant dimerizes and trans-phosphorylates the immature wild-type FGFR3 supporting the hypothesis that dimerization of mutant and wild-type FGFR3 causes the retention of the latter in the ER. This may explain the genetic dominance of the K650E allele in the TDII disease. Fluorescence-based protein fragment complementation assay confirms FGFR3 dimerization in vivo and indicates FGFR3 as a cargo of the mannose-specific lectin ERGIC-53. Altogether these data highlight transient dimerization as a step in the FGFR3 biosynthesis and we hypothesize that this event could be part of a ‘pre-assembly quality control’ of the receptor, since the receptor function on the cell surface is exerted through the homo-dimerization upon the interaction with the specific FGF ligand. Furthermore, we show for the first time the presence of ERGIC53/FGFR3 complexes, suggesting a role for ERGIC53 in the transport of the FGFR3 from the ER to the Golgi. Finally, we observed that FGFR2, another member of the FGFR family, also shows a ‘basal’ level of dimerization of the immature mannose-rich isoforms, suggesting that intracellular dimerization could be a mechanism shared by all the members of the FGFRs family.