Expression and structural studies of insulin-like growth factor binding proteins and the c-terminal domain of perlecan

Insulin-like Growth Factors (IGFs), Insulin-like Growth Factor Binding Proteins (IGFBPs) e Insulin-like Growth Factor Binding Proteins-related Proteins (IGFBP-rP). Le IGF-I e IGF-II sono piccoli ormoni peptidici di 70 e 67 amminoacidi rispettivamente. Essi sono così chiamati a causa della loro alta omologia con l’insulina. Le IGF hanno effetti a livello cellulare promuovendo la crescita e il differenziamento, vengono legate in vivo dalle IGFBP e da 2 tipi di recettori (recettore tipo 1 e tipo 2) che mediano i loro effetti. Le IGFBP costituiscono una famiglia di 6 proteine (da IGFBP-1 a -6) le cui dimensioni vanno da 216 a 289 amminoacidi di lunghezza. Dal punto di vista strutturale, esse sono suddivise in tre domini: un dominio ammino-terminale conservato ricco in cisteine, una regione centrale non conservata e un dominio carbossi-terminale conservato. La capacità di legare IGF permette alle IGFBP di regolare la concentrazione di IGF circolanti, di sequestrarle o di concentrarle in prossimità dei tessuti bersaglio. Le IGFBP però possono dare degli effetti biologici anche indipendentemente dal legame con le IGF. E’ stato dimostrato, ad esempio, da studi condotti utilizzando frammenti delle IGFBP che questi sono in grado di influenzare l’adesione cellulare attraverso il legame con le integrine. Nel complesso, il sistema delle IGF è coinvolto in numerosi processi nell’organismo e sempre più patologie sono state correlate al suo malfunzionamento. Successivamente, sono state identificate altre proteine che mostrano omologia per le IGFBP, limitatamente al dominio ammino-terminale, le quali possono legare le IGF con affinità inferiore rispetto alle IGFBP. Si è proposto quindi di chiamare queste proteine IGFBP-related proteins. In questo lavoro di tesi la IGF-II umana ricombinante è stata espressa in Escherichia coli , inizialmente come proteina depositata in corpi d’inclusione e successivamente in forma solubile. La proteina prodotta in corpi d’inclusione è stata solubilizzata, purificata mediante cromatografia di affinità (tramite una coda di 6 istidine legata alla proteina), ed è stata intrapresa la rinaturazione. La proteina così ottenuta è stata cristallizzata ma i cristalli ottenuti non hanno consentito di determinarne la struttura mediante analisi di diffrazione di raggi X. La proteina in forma solubile è stata ottenuta cambiando vettore di espressione ma la bassa specificità per la matrice di affinità usata ha posto problemi per la sua purificazione. E’ stata poi espressa la IGFBP-3 umana utilizzando il lievito metilotrofico Pichia pastoris . La proteina è stata purificata mediante cromatografia a scambio ionico e gel-filtrazione ed è stata tentata la cristallizzazione che però non ha dato risultati. Inoltre è stata espressa e purificata la IGFBP-rP1 in Escherichia coli . La proteina è stata purificata mediante cromatografia di affinità (utilizzando una resina Nickel Sepharose che lega la coda di istidine fusa alla proteina ricombinante), e utilizzata per l’allestimento delle prove di cristallizzazione preliminari. Una delle condizioni testate ha dato dei cristalli che però non possono ancora essere usati per risolvere la struttura tridimensionale. Dominio LG-3 (Laminin G-like) del perlecano umano. Il perlecano umano è un eparan-solfato proteoglicano, costituito da un nucleo proteico del peso di 470 kDa legato a oligosaccaridi e catene di eparan solfato che portano il peso complessivo del perlecano fino a 800 kDa. Esso costituisce, insieme a collagene e laminine la membrana basale, cioè una matrice specializzata presente nell’endotelio, nell’epitelio e attorno alle cellule muscolari. Il dominio carbossi-terminale del perlecano (dominio V del peso di 85 kDa) è chiamato endorepellina ed è stata dimostrata la sua capacità di funzionare come fattore anti-angiogenico. Il dominio LG-3 del perlecano umano è stato espresso come proteina ricombinante in Escherichia coli e purificato tramite cromatografia di affinità sfruttando una coda di istidine. La proteina è stata quindi cristallizzata ed è stata determinata la sua struttura tridimensionale mediante analisi di diffrazione di raggi X. α1-Microglobulina. L’α1-microglobulina è una lipocalina, è costituita da 183 amminoacidi e pesa 26 kDa. L’α1-microglobulina umana è glicosilata in tre posizioni, due delle quali sono siti di N-glicosilazione e una e un sito di O-glicosilazione. Essa viene sintetizzata nel fegato come proteina di fusione insieme ad un’altra proteina, la bikunina, e viene successivamente tagliata e immessa nel plasma. Una importante funzione della α1-microglobulina è la sua capacità di modulare negativamente l’attività del sistema immunitario proteggendo i tessuti dalla risposta immunitaria. L’ α1-microglobulina di topo è stata espressa come proteina ricombinante utilizzando il lievito Pichia pastoris . La proteina è stata purificata tramite cromatografia a scambio ionico e gel filtrazione. La proteina purificata è stata quindi utilizzata per l’allestimento delle prove preliminari di cristallizzazione che però non hanno dato risultati.

Insulin-like Growth Factors (IGFs), Insulin-like Growth Factor Binding Proteins (IGFBPs) and Insulin-like Growth Factor Binding Proteins-related Proteins (IGFBPrP). IGF-I and IGF-II are small hormone peptides of 70 and 67 amino acids respectively and are called insulin-like because of their homology with insulin. IGFs promote cellular growth and differentiation, bind IGFBPs in vivo and also two types of receptors (type 1 and type 2 receptor) which mediate their actions. The IGFBPs form a six member family (IGFBP-1 to -6) and are between 216 to 289 amino acids long. They are subdivided into three distinct domains: a conserved amino-terminal cysteine-rich region, a non-conserved midregion, and a conserved carboxy-terminal region. The IGFBPs bind the circulating IGFs thus regulating their concentration, by sequestering them or releasing them in proximity of their target tissues. In addition, IGFBP effects independent of IGFbinding have been demonstrated. Studies with proteolyzed fragments of IGFBPs unable to bind IGFs, have shown their ability to influence cellular adhesion by integrin binding. The IGF system is involved in various processes and many pathological events have been related to its failure. In addition, other proteins have been identified which have the ability to bind IGFs with lower affinity, compared to IGFBPs. These proteins show homology with IGFBPs in their amino-terminal region and are called IGFBP-related proteins. During this thesis, human IGF-II was expressed in Escherichia coli , in the form of inclusion bodies and in its soluble form. The protein from inclusion bodies was solubilized, purified by affinity chromatography (using a 6 histidine tag), and then refolded. The renatured protein was crystallized but with the data obtained from those crystals it was not possible to determine the three dimensional structure. The soluble form was obtained by using a different expression vector and a 6 histidine tag but purification using the tag was not possible due to the low affinity for the chromatography resin. Human IGFBP-3 was also expressed using the methylotrophic yeast Pichia pastoris . The recombinant protein was purified by ion-exchange chromatography and by gel-filtration but the crystallization trials did not yield good crystals. Human IGFBP-rP1 was expressed in Escherichia coli , purified by affinity chromatography and used for preliminary crystallization trials. One crystallization condition gave small crystals which are still not suitable for X-ray diffraction analysis. LG-3 (Laminin G like) domain of the human perlecan Human perlecan is an heparan-sulphate proteoglycan, containing a protein core of 470 kDa with oligosaccharides and heparan sulphate chains attached to it which give a total molecular weight of 800 kDa. Together with collagen and laminin it forms the basement membrane which is a specialized matrix found in epithelium, endothelium and surrounding muscle cells. The carboxy-terminal domain of perlecan (domain V of 85 kDa) is called endorepellin and possesses anti-angiogenic activity The LG-3 domain of human perlecan was expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. The purified protein was then crystallized and its molecular structure was determined by X-ray diffraction analysis. α1-Microglobulin. α1-Microglobulin is a lipocalin of 26 kDa and is 183 amino acids long. Human α1-microglobulin is glycosylated in three positions: two of these are of the Nlinked type and the third one is of the O-linked type. α1-Microglobulin is synthesized in the liver as a fusion protein with bikunin from which it is subsequently cleaved and released into plasma. The biological function of α1- microglobulin is related to its ability to negatively modulate the immune system activity thus preventing tissue damage by immunological responses. Mouse α1-microglobulin was expressed as a recombinant protein by using the yeast Pichia pastoris . The protein was purified by ion-exchange chromatography and gel filtration and preliminary crystallization trials were prepared which gave no crystals.