Studio della S-nitrosilazione in vitro e in vivo in Arabidopsis thaliana

L’ossido nitrico (NO) è una molecola segnale di importanza centrale in numerosi processi cellulari sia negli animali sia nelle piante. In particolare l’NO agisce nelle piante sia come regolatore dello sviluppo in quanto coinvolto in processi fisiologici come la germinazione, la crescita di foglie e radici, la senescenza e la fioritura, sia come segnale chiave nella risposta difesa contro i patogeni. Tuttavia pur essendo noti i numerosi processi fisiologici in cui l’NO è coinvolto, ancora non risultano chiari quali siano i suoi specifici “target” molecolari. La S-nitrosilazione consiste nel legame di un gruppo NO al tiolo libero di una cisteina. Nei sistemi animali questa modificazione è risultata essere responsabili dell’alterazione, attraverso cambiamenti della struttura e della conformazione, dell’attività di proteine coinvolte in processi cruciali della cellula, quali l’apoptosi. Inoltre essendo molto specifica l’S-nitrosilazione potrebbe rappresentare un meccanismo di controllo e di trasduzione del segnale durante particolari condizioni della cellula specie in relazione alle risposte stress a ossidativo e nitrosativo. In questo lavoro di tesi è stato messo a punto un saggio per l’analisi dell’Snitrosilazione in pianta. Come riferimento è stato preso il metodo “biotin switch” (Jaffrey e coll., 2001) che permette di convertire le proteine S-nitrosilate in proteine biotinilate, in modo da riconoscerle attraverso il loro legame specifico all’anticorpo anti-biotina o di isolarle tramite cromatografia di affinità. Il protocollo è stato adattato alla rilevazione e all’isolamento delle proteine S-nitrosilate in pianta, seguita da analisi tramite tecniche di elettroforesi bidimensionale. Il metodo è stato quindi utilizzato per identificare le proteine di A. thaliana S-nitrosilate in vitro e quelle S-nitrosilate in vivo durante la risposta ipersensibile (HR), meccanismo di difesa della pianta dai patogeni avirulenti che porta ad una morte cellulare programmata nella zona d’infezione. Trattando estratti proteici di A. thaliana con agente nitrosilante, nello specifico Snitrosoglutatione (GSNO) ed effettuando il “biotin switch” seguito da analisi in gel bidimensionali è stato possibile identificare, tramite spettrometria di massa MALDITOF, 55 proteine S-nitrosilate. Tra queste proteine sono stati ritrovati enzimi del sistema antiossidante, proteine coinvolte nella detossificazione di sostanze tossiche e nella regolazione dello stato redox, proteine coinvolte nella risposta a stress biotici e abiotici. Il sistema utilizzato è stato quindi applicato all’analisi delle proteine S-nitrosilate di A. thaliana differenzialmente espresse durante la HR. L’analisi delle proteine soggette a S-nitrosilazione in pianta dopo l’infezione del patogeno avirulento Pst AvrB ha portato all’identificazione, tramite spettrometria di massa MALDI-TOF, di 18 proteine tra cui la perossiredossina II E (Prx II), enzima coinvolto nella detossificazione dell’H2O2. L’S-nitrosilazione della Prx II E è stata verificata in vivo e in vitro dopo trattamento con GSNO; inoltre è stato verificato che la modificazione post-traduzionale, che avviene 8h dopo l’infezione del patogeno avirulento, riguarda l’intero “pool” di proteina presente durante la HR.

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