Theoretical outcomes and applications of taxonomic studies on the genera Enterococcus and Lactobacillus

Questo progetto di dottorato, dal titolo “Theoretical outcomes and applications of taxonomic studies on the genera Enterococcus and Lactobacillus”, si colloca nel contesto della tassonomia batterica. Tale disciplina scientifica si propone di descrivere la diversità degli organismi viventi con lo scopo di caratterizzarli e di raggrupparli in un sistema gerarchico ordinato. È convinzione diffusa che il sistema di classificazione più stabile e affidabile sia quello che si basa sulle reali relazioni genealogiche degli organismi. Tuttavia, data la loro semplicità strutturale, lo studio dei batteri è sempre stato fortemente influenzato dallo sviluppo scientifico e dalle tecnologie di indagine disponibili. I microrganismi ricoprono notevole interesse in diverse aree scientifiche, quali la medicina, la genetica, l’ecologia e trovano ampia applicazione nell’industria alimentare, farmaceutica e nel settore ambientale. Lo studio della biodiversità esistente è indispensabile per impiegare al meglio i microrganismi, per scoprire nuove applicazioni biotecnologiche nonché per approfondire i rischi derivanti dalla presenza di batteri indesiderati o pericolosi. La tassonomia, inoltre, ha il compito di assegnare un nome univoco ad ogni organismo fino ad ora caratterizzato, in modo tale da consentire lo scambio delle informazioni disponibili tramite l’utilizzo di una terminologia comune e di fornire strumenti utili alla corretta identificazione di nuovi isolati. Nel corso di questo progetto sono state approfondite alcune problematiche tassonomiche legate a specie appartenenti ai generi Lactobacillus ed Enterococcus, che includono batteri di notevole interesse ecologico e applicativo, in particolare, nella produzione di alimenti fermentati dove vengono impiegati come commensali o starter. Alcune specie, inoltre, sono comuni abitanti del tratto gastro-intestinale dell’uomo e degli animali e possono influire sulla composizione della microflora intestinale, sull’assorbimento dei nutrienti e sullo stato di salute dell’ospite. Data la loro diffusione in ambienti così differenti e il ruolo che ricoprono in diversi settori, l’approfondimento tassonomico di questi generi risulta particolarmente rilevante. Le ricerche svolte nell’ambito di questo progetto sono state affrontate con l’ausilio di approcci differenti a seconda dell’organismo preso in esame, della problematica da risolvere e del livello tassonomico investigato (tra specie distinte, strettamente correlate o fra individui di una stessa specie). Nella prima parte della tesi (capitolo 2) sono state approfondite le relazioni filogenetiche tra enterococchi tramite l’analisi di sequenza di sei diversi marcatori molecolari (16S rDNA, recA, hsp60, pheS, atpA, rpoA) e il confronto dell’organizzazione genica delle regioni adiacenti al gene recA. Questo approccio ha permesso di evidenziare la presenza di gruppi di specie maggiormente correlate tra loro e di valutare un probabile ordine di speciazione. I dati di sequenza ottenuti sono stati analizzati per individuare dei polimorfismi specie-specifici sui geni 16S rRNA, recA e hsp60, in corrispondenza dei quali sono state disegnate delle sonde da impiegare a fini diagnostici. Queste sonde, utilizzate per lo sviluppo di un prototipo di DNA-microarray tramite deposizione meccanica, hanno consentito di differenziare, sulla base dei profili di ibridazione ottenuti, le specie di enterococchi che si ritrovano più frequentemente in campioni clinici e in matrici alimentari, alcune delle quali, come E. durans ed E. hirae, sono in genere difficilmente distinguibili con altri metodi molecolari e fenotipici. Nella seconda parte (capitoli 3 e 4) sono state affrontate due problematiche di classificazione tra specie strettamente correlate (L. ingluviei e L. thermotolerans, L. vaccinostercus e L. durianis), che mostrano una elevata conservazione dei marcatori molecolari e proprietà fenotipiche molto simili. Pertanto, il loro grado di similarità è stato determinato tramite ibridazione del DNA totale, l’unico metodo attualmente valido per la delimitazione di una specie batterica. Dai risultati ottenuti è stato possibile accertare che le unità tassonomiche non differenziabili rappresentano in realtà una singola specie, erroneamente annotata nel sistema di classificazione con nomi diversi. Come conseguenza di queste evidenze lo schema di classificazione del genere Lactobacillus e il sistema di nomenclatura di questi organismi è stato corretto, in modo tale da consentire in futuro una più chiara e non ambigua identificazione di isolati ambientali. Nella terza parte (capitoli 5 e 6) è stata approfondita la biodiversità microbica a livello intraspecifico di due specie che ricoprono un ruolo rilevante in diverse produzioni alimentari, L. plantarum e L. delbrueckii. Per la specie L. plantarum è stato confrontato il contenuto genico di ceppi di diversa origine tramite l’utilizzo di DNA-microarray commerciali su cui è rappresentato il genoma completo del ceppo WCFS1, interamente sequenziato nel 2003. Gli esperimenti di ibridazione hanno evidenziato una notevole eterogeneità genetica che correla con i profili fenotipici dei ceppi considerati. Un ulteriore approfondimento di queste osservazioni consentirà, tramite l’utilizzo di supporti bioinformatici dedicati, di valutare più chiaramente il legame tra specifici determinanti genici e proprietà fisiologiche in un’ottica di genomica funzionale. Nel capitolo 6 è riportata per la prima volta la presenza di due distinte vie metaboliche, una mediata da permeasi e l’altra da un trasportatore fosfoenol-piruvato dipendente, responsabili del trasporto e della degradazione del lattosio nella specie L. delbrueckii. La presenza/assenza e l’espressione di una o dell’altra via metabolica sono legate all’ecologia, alle proprietà tecnologiche e all’evoluzione delle quattro subspecie attualmente descritte, L. delbrueckii subsp. lactis, bulgaricus, delbrueckii e indicus. I risultati ottenuti costituiscono un originale contributo per valutare con più rigore la flessibilità di queste specie batteriche e la funzionalità dei singoli isolati che li rendono differentemente adatti a sopravvivere in determinati ambienti (latte, vegetali) e a trovare impiego in diversi processi dell’industria alimentare (produzione di yogurt o formaggi). In conclusione, gli studi tassonomici riportati hanno contribuito a migliorare lo schema di classificazione dei batteri investigati, chiarendo le eventuali ambiguità del sistema di nomenclatura. Inoltre, è evidente come la ricerca di base possa avere notevoli risvolti applicativi quali l’approfondimento di tratti funzionali, utili per la selezione di organismi di rilevanza tecnologica. Non da ultimo, l’eterogeneità osservata consente di comprendere più chiaramente la flessibilità genetica che spinge questi organismi ad evolvere rapidamente e ad adattarsi all’ambiente che li circonda.

The present thesis, titled “Theoretical outcomes and applications of taxonomic studies on the genera Enterococcus and Lactobacillus”, concerns taxonomy of bacteria. This scientific discipline aims at studying all living organisms with the final goal of characterizing and arranging them in an orderly manner on the basis of their similarity and relationships. The classification scheme based on the real genealogical relationships of living organisms is considered the most stable. However, as a consequence of their simple structure, bacteria investigation has been strongly influenced by scientific and technical advances. Microbes certainly play a crucial role in several scientific area, such as medicine, genetics, ecology and they are largely employed in food production industry, pharmacology and environmental science. Thus, it is necessary to study existing biodiversity in order to use microorganisms for human activities, to discover new biotechnological applications and to deep the risks linked to the presence of unwanted or even dangerous bacteria. Moreover, taxonomy assigns a unique name to each described organism, in order to provide information exchange by using a common terminology and to provide tools or methods to improve the correct identification of new isolates. During this project different taxonomic aspects have been faced concerning some species belonging to the genera Lactobacillus ed Enterococcus, which include relevant bacteria for ecological and applicative purpose, in particular, for fermented food production where they are largely employed as natural component or as starter. Some species are marked as common inhabitant of the gastro-intestinal tract of human and animals and they can modulate the microflora composition, nutrient assimilation as well as the general health status of the host. Due to their presence in so different environments and their application in several human area, their study appear particularly interesting and necessary. The present project has been carried out by using different approaches based on the aspect to be evaluated, the organism and the taxonomic rank under investigation (i.e. the comparison of distinct or strictly correlated species and the analysis of strains belonging to the same taxonomic unit). In the first part of this dissertation (chapter 2) is presented an evaluation of the phylogenetic relationships among enterococci by using a comparative sequence analysis of six molecular markers (16S rDNA, recA, hsp60, pheS, atpA, rpoA) and synteny of the region flanking recA gene. These approaches allowed to underline the presence of distinct groups of closely related species and to hypothesize their speciation order. The obtained gene sequence data of three target genes, 16S rRNA, recA e hsp60, were analysed in order to design diagnostic probes in correspondence of species-specific polymorphisms. The designed probes, employed to develop a prototype of spotted DNA-microarray, permitted to distinguish, on the basis of the obtained hybridization profiles, the Enterococcus species which are more frequently detected in clinical samples and in several food production chains, e.g. E. durans and E. hirae, usually hardly differentiated by the use of other molecular and phenotypic methods. In the second part (chapters 3 and 4) other two aspects, involving closely related species (L. ingluviei e L. thermotolerans, L. vaccinostercus e L. durianis) have been faced. These species showed highly conserved molecular markers and similar phenotypic properties. Thus, their degree of similarity has been determined by DNA-DNA hybridization, that is the unique valid method to circumscribe a bacterial species. Obtained results permitted to evidence that these closely related taxa belong to a single species, and they were wrongly classified with different names. As a consequence of these evidences, the classification scheme of Lactobacillus genus and the nomenclature of these organisms were corrected, in order to allow in the future a more clear and unambiguous identification of natural isolates. In the third part of the thesis (chapters 5 and 6) it is reported an exploration of microbial biodiversity at inter-specific level, in particular of two relevant species largely employed in several food production processes, i.e. L. plantarum and L. delbrueckii. Concerning the L. plantarum species, the gene-content of strains of different isolation origin was evaluated by using commercial DNA-microarray representing the complete genome of WCFS1 strain, sequenced in the 2003. Hybridization experiments highlighted an consistent genetic heterogeneity which seems correlatine with the phenotypic profiles of the considered strains. A further evaluation of these observations, by the application of powerful bioinformatic tools, will permit to match specific genetic determinants and physiological properties in a functional genomic perspective. In chapter 6 the presence of two distinct metabolic pathways, responsible for lactose transport and degradation in L. delbrueckii species, is reported for the first time: one involves a permease and the other a phosphoenol-pyruvate dependent system. The presence/absence and transcription regulation of the first or of the second metabolic pathway seemed linked to ecology, technological properties and evolution of the four subspecies, L. delbrueckii subsp. lactis, bulgaricus, delbrueckii and indicus. The presented observations represent an original contribution to appraise the flexibility of this bacterial species and functionality of single isolates made them able to survive in different habits (milk, vegetable) and to be employed in several food industry processes (e.g. yogurt or cheese production). In conclusion, the reported taxonomic studies have contributed to improve the classification scheme of the investigated bacteria and removing some ambiguous aspects of the nomenclature system. Moreover, it is highlight the applications of basic research studies such as a deep evaluation of functional traits and criteria, helpful to the selection of organism of technological relevance. Finally, the observed heterogeneity furnish a more clear view of genetic flexibility which force these organisms to rapidly evolve and to easily adapt to the several environments.