L’attività di ricerca svolta in questa tesi ha riguardato due diversi progetti. Il primo concerne il problema della coinfezione da parte del retrovirus HTLV-2 di soggetti tossicodipendenti italiani che sono infettati da HIV-1, allo scopo di comprendere l’interazione tra i due retrovirus a livello cellulare e stabilire quale possa essere l’effetto sulla progressione dell’AIDS. Il secondo è centrato sullo studio e della funzione delle proteine Tax di HTLV-1 (Tax-1) e HTLV-2 (Tax-2) e sulla caratterizzazione, mediante mutagenesi, dei domini proteici specifici che modulano la funzione stessa. Il primo progetto ha comportato la messa a punto di analisi di PCR quantitativa e la determinazione del carico provirale di HTLV-2 in diversi soggetti infettati e la caratterizzazione molecolare degli isolati di HTLV-2. Dalle analisi compiute sulla popolazione coinfettata e monoinfettata da HIV-1 è risultato che il numero di pazienti “long-term non progressors” verso l’ AIDS è significativamente più alto nel gruppo dei coinfetti HIV-1/HTLV-2 rispetto a quello dei monoinfetti HIV-1. Questi dati indicano chiaramente che HTLV-2 ha un effetto protettivo contro la progressione dell’AIDS. Nel gruppo dei soggetti coinfettati da HIV-1/HTLV-2 sono stati seguiti 5 pazienti sottoposti a terapia antiretrovirale per HIV-1 ed è stato riscontrato un significativo aumento del carico provirale di HTLV-2 e un concomitante decremento in viremia HIV-1 in seguito al trattamento. Questi dati suggeriscono che la terapia antivirale contro l’HIV-1 è inefficace a contenere l’infezione da HTLV-2. La prima parte del secondo progetto ha riguardato l’analisi della localizzazione di Tax-2. A tal fine, il gene tax-2 è stato clonato in un vettore di espressione per cellule di mammifero, aggiungendo in frame all’estremità Cterm la “Green Fluorescent protein” (GFP). L’espressione transiente in cellule HeLa e 293T e la rilevazione tramite microscopia a fluorescenza hanno evidenziato una distribuzione citoplasmatica della proteina in forma punteggiata. Lo stesso procedimento è stato eseguito su mutanti della stessa proteina troncata progressivamente all’estremità C-term e fusa con GFP: 331-GFP, 156- GFP, 115-GFP, 60-GFP. Le immagini al microscopio a fluorescenza hanno confermato una localizzazione di Tax-2 a livello citoplasmatico, ad eccezione del clone 60-GFP, il quale risulta esclusivamente nucleare. L’ulteriore riduzione della proteina ai primi 33 aa mostra una distribuzione della fluorescenza diffusa a tutta la cellula, simile a quella ottenut a dall’espressione della sola proteina GFP. Questi dati confermano la presenza di un “nuclear localization determinant” (NLD) nei primi 60 aa della proteina. Al fine di caratterizzare più precisamente questa parte di Tax-2, sono stati analizzati numerosi mutanti per piccole delezioni aminoacidiche sul clone 60-GFP. Tutti i cloni analizzati, ad eccezione di quello che presenta la delezione 17-20, hanno mostrato una localizzazione nucleare, indicando che mutazioni puntiformi non sono in grado di perturbare la funzionalità del NLD. È stato possibile infine circoscrivere ulteriormente il NLD agli aa 1-41 in quanto, togliendo i primi 21 aa, si riscontra la perdita di funzionalità del NLD stesso. La seconda parte del progetto, riguardante la funzione della proteina Tax, è stata centrata sull’analisi comparativa della localizzazione cellulare di Tax-1 e Tax-2. Per fare questo sono stati clonati i geni tax-1 e tax-2 aggiungendo in frame all’estremità C-term delle proteine dei tag di diverso tipo: la GFP, la Yellow Fluorescent Protein (YFP) (~27 KDa), la proteina Halo (~30 KDa) ed una sequenza aminoacidica di 32 aa contenente l’epitopo V5 (~3 KDa). I cloni di Tax-1, -GFP, -YFP, -Halo e -V5 hanno mostrato una localizzazione prevalentemente nucleare, mentre i cloni di Tax-2, -GFP, -YFP e -Halo sono risultati prevalentemente citoplasmatici. Quando Tax-2 è stata clonata ed espressa con un tag di minor dimensioni quale V5, si è ottenuta una localizzazione prevalentemente nucleare. Questi risultati hanno permesso di dimostrare che l’utilizzo di tag di diverse dimensioni può modulare diversamente la localizzazione delle due proteine, in particolar modo Tax-2. Per identificare le regioni delle due proteine coinvolte nella regolazione della localizzazione cellulare, sono stati fatti esprimere mutanti sia di Tax-1 che di Tax-2 progressivamente troncati all’estremità C-term e fusi con il tag V5. Mettendo a confronto le immagini al microscopio confocale di questi mutanti è stata osservata una distribuzione cellulare molto simile per Tax-1 e Tax-2, anche nelle rispettive forme troncate: prevalentemente nucleari per Tax-1 e Tax-2 “full-length”e per la forma 1-340 e nucleo-citoplasmatiche per gli altri mutanti troncati di dimensioni inferiori. Data la mancanza di un anticorpo specifico contro Tax-2, è necessario di utilizzare sistemi tag per l’espressione ed il riconoscimento di Tax-2 all’interno della cellula per studiarne la localizzazione. Questo ha messo in evidenza che quest’ultima è particolarmente suscettibile alle modificazioni apportate dall’aggiunta di tag in posizione N-term e C-term. Per ovviare a questo problema, si è deciso di preparare costrutti di espressione per Tax-1 e Tax-2 inserendo il tag Flag-H6 all’interno della molecola proteica, tra gli aminoacidi 337 e 338 delle due proteine. Mettendo a confronto la localizzazione di Tax-1 nativa senza tag e quella di Tax-1 utilizzando il tag Flag-H6 in posizione 337, si è visto che questo ultimo non interferisce sui meccanismi che regolano la localizzazione di Tax-1. È stato inoltre possibile stabilire anche per Tax-2 che il tag Flag-H6 posto in posizione 337 permette una corretta lo calizzazione della proteina a livello nucleare. Utilizzando questo sistema di espressione è stato possibile mettere in evidenza alcune caratteristiche funzionali di Tax-2 che non erano ancora state dimostrate. Si è visto infatti che Tax-2 si localizza in modo specifico in strutture nucleari simili ai nuclear bodies (NB) tipici di Tax-1 e che la sua espressione è in grado di determinare un accumulo specifico del fattore RelA di NFKB a livello nucleare nelle stesse strutture. In conclusione questo studio ha permesso di chiarire l’interazione tra HTLV-2 and HIV in soggetti coinfettati ed ha prodotto nuove importanti informazioni sul problema della distribuzione cellulare di Tax-1 e Tax2. Il complesso meccanismo responsabile dell’attività pleiotropica delle due proteine potrà essere chiarito in futuro mediante un'analisi appropriata delle loro modificazioni post-traduzionali

The research activity carried out in this thesis covered two different projects. The first one concerns the problem of the infection by the retrovirus HTLV-2 of Italian intravenous drug users who are also infected by HIV-1, to understand the interaction between the two retroviruses at the cellular level and define the effect of coinfection on AIDS progression. The second is centered on the study and function of Tax proteins of HTLV-1 (Tax-1) and HTLV-2 (Tax-2) and the characterization by mutagenesis of specific protein domains that modulate their function. The first project entailed the development of quantitative PCR analysis and the determination of the proviral load of HTLV-2 in infected subjects and the molecular characterization of HTLV-2 isolates. From the analyses carried out on these subjects it was found that the number of long term non-progressors for AIDS is significantly higher among HIV-1/HTLV-2 coinfected patients than HIV-1 monoinfected cases. These data clearly indicate that HTLV-2 is exerting a protective effect against AIDS progression. Five coinfected subjects undergoing antiretroviral therapy showed a significant increase in HTLV-2 proviral load concomitant to a decrease in HIV-1 viremia, suggesting that the treatment against HIV-1 is ineffective against HTLV-2 infection. The first part of the second project involved the analysis of Tax-2 localization. To this end, tax-2 gene was cloned into an expression vector adding in frame the Green Fluorescent Protein (GFP) to C-term end. The transient expression in HeLa and 293T cells and the detection by fluorescent microscopy revealed that Tax-2 was preferentially distributed in the cytoplasm and formed single dots. To possibly understand the role of C-terminal domain in protein localization, the same expression procedure was performed for Tax-2 mutants progressively truncated at the C-term and merged with GFP: 331-GFP, GFP 156-, 115-GFP, 60-GFP. Fluorescence microscopy confirmed that Tax-2 was localized in the cytoplasm, with the exception of mutant 60-GFP, which was exclusively nuclear. Further reduction to 33 aa fragment showed a widespread cellular fluorescence, similarly that obtained for full length Tax-2-GFP. These data confirmed the presence of a "nuclear localization determinant" (NLD) in the first 60 aa of Tax-2. To more precisely characterize this N-terminal part of the protein, several mutants for single or small amino acid deletions of clone 60- GFP were analyzed. All clones, with the exception of a mutant with 17-20 deletion, presented a nuclear localization, indicating that point mutations are not changing NLD function. Instead, by removing the first 21 aa, NLD function was lost, suggesting that the first 41 aa are necessary for NLD function. The second part of the project on Tax function was centered on the study of comparative cellular localization of Tax-1 and Tax-2. Tax-1 and tax-2 were cloned by adding in frame at C-term different types of protein tags: GFP, Yellow Fluorescent Protein (YFP) (~ 27 KDa ), Halo protein (~ 30 KDa) and a sequence of 32 amino acid containing the epitope V5 (~ 3 KDa). The expression of Tax-1, -GFP, -YFP, -Halo and -V5 showed a predominantly nuclear localization, whereas that of Tax-2 linked to GFP, YFP or Halo was predominantly cytoplasmic. When Tax-2 was cloned and expressed using the small tag V5, a predominantly nuclear localization was obtained. These results demonstrated that using tags of different sizes can induce different localizations of the two proteins. To identify the regions of the two proteins involved in regulating cellular localization, Tax-1 and Tax-2 mutants progressively truncated at the C-term and merged with the tag V5 were constructed and expressed. A very similar cellular distribution for Tax-1 and Tax-2 was obtained, as visualized by confocal microscopy: predominantly nuclear for both Tax-1 and Tax-2 full length and 1- 340 forms and cytoplasmic for truncated mutants below the first 300 aa. Since no adequate antibody is available to recognise native Tax-2 expression inside the cell, adding a tag to the terminal parts of the protein becomes necessary, though these conformational changes could result in abnormal localization effect. It was thus decided to prepare constructs for Tax -1 and Tax-2 expression by inserting internally to the protein structure the tag Flag- H6 between amino acids 337 and 338. By comparing the localization of native Tax-1 without tags and Tax-1 with the 337 Flag-H6, it was found that this does not interfere with the mechanisms regulating Tax-1 localization and function. It was also found that 337 Flag-H6 presented a nuclear localization and was adequately functional. Using this expression system allowed to show that also Tax-2 is located in specific nuclear complexes that are similar, but not identical, to the nuclear bodies (NB) formed by Tax-1 and that their expression is responsible for a specific accumulation of RelA NFKB factor at nuclear level. In conclusion, this study has allowed further understanding of the crossinteraction between HTLV-2 and HIV in coinfected subjects, and has given new important clues on the problem of cellular distribution and function of Tax-1 and Tax-2. The complex mechanisms that are responsible for the pleiotropic activities of the two proteins will be further clarified in the future by investigating their post-translational modifications.

Studio dell'espressione in cellule umane dell'oncoproteina Tax dei virus leucemogeni umani HTLV-1 e HTLV-2

TURCI, Marco
2008-01-01

Abstract

The research activity carried out in this thesis covered two different projects. The first one concerns the problem of the infection by the retrovirus HTLV-2 of Italian intravenous drug users who are also infected by HIV-1, to understand the interaction between the two retroviruses at the cellular level and define the effect of coinfection on AIDS progression. The second is centered on the study and function of Tax proteins of HTLV-1 (Tax-1) and HTLV-2 (Tax-2) and the characterization by mutagenesis of specific protein domains that modulate their function. The first project entailed the development of quantitative PCR analysis and the determination of the proviral load of HTLV-2 in infected subjects and the molecular characterization of HTLV-2 isolates. From the analyses carried out on these subjects it was found that the number of long term non-progressors for AIDS is significantly higher among HIV-1/HTLV-2 coinfected patients than HIV-1 monoinfected cases. These data clearly indicate that HTLV-2 is exerting a protective effect against AIDS progression. Five coinfected subjects undergoing antiretroviral therapy showed a significant increase in HTLV-2 proviral load concomitant to a decrease in HIV-1 viremia, suggesting that the treatment against HIV-1 is ineffective against HTLV-2 infection. The first part of the second project involved the analysis of Tax-2 localization. To this end, tax-2 gene was cloned into an expression vector adding in frame the Green Fluorescent Protein (GFP) to C-term end. The transient expression in HeLa and 293T cells and the detection by fluorescent microscopy revealed that Tax-2 was preferentially distributed in the cytoplasm and formed single dots. To possibly understand the role of C-terminal domain in protein localization, the same expression procedure was performed for Tax-2 mutants progressively truncated at the C-term and merged with GFP: 331-GFP, GFP 156-, 115-GFP, 60-GFP. Fluorescence microscopy confirmed that Tax-2 was localized in the cytoplasm, with the exception of mutant 60-GFP, which was exclusively nuclear. Further reduction to 33 aa fragment showed a widespread cellular fluorescence, similarly that obtained for full length Tax-2-GFP. These data confirmed the presence of a "nuclear localization determinant" (NLD) in the first 60 aa of Tax-2. To more precisely characterize this N-terminal part of the protein, several mutants for single or small amino acid deletions of clone 60- GFP were analyzed. All clones, with the exception of a mutant with 17-20 deletion, presented a nuclear localization, indicating that point mutations are not changing NLD function. Instead, by removing the first 21 aa, NLD function was lost, suggesting that the first 41 aa are necessary for NLD function. The second part of the project on Tax function was centered on the study of comparative cellular localization of Tax-1 and Tax-2. Tax-1 and tax-2 were cloned by adding in frame at C-term different types of protein tags: GFP, Yellow Fluorescent Protein (YFP) (~ 27 KDa ), Halo protein (~ 30 KDa) and a sequence of 32 amino acid containing the epitope V5 (~ 3 KDa). The expression of Tax-1, -GFP, -YFP, -Halo and -V5 showed a predominantly nuclear localization, whereas that of Tax-2 linked to GFP, YFP or Halo was predominantly cytoplasmic. When Tax-2 was cloned and expressed using the small tag V5, a predominantly nuclear localization was obtained. These results demonstrated that using tags of different sizes can induce different localizations of the two proteins. To identify the regions of the two proteins involved in regulating cellular localization, Tax-1 and Tax-2 mutants progressively truncated at the C-term and merged with the tag V5 were constructed and expressed. A very similar cellular distribution for Tax-1 and Tax-2 was obtained, as visualized by confocal microscopy: predominantly nuclear for both Tax-1 and Tax-2 full length and 1- 340 forms and cytoplasmic for truncated mutants below the first 300 aa. Since no adequate antibody is available to recognise native Tax-2 expression inside the cell, adding a tag to the terminal parts of the protein becomes necessary, though these conformational changes could result in abnormal localization effect. It was thus decided to prepare constructs for Tax -1 and Tax-2 expression by inserting internally to the protein structure the tag Flag- H6 between amino acids 337 and 338. By comparing the localization of native Tax-1 without tags and Tax-1 with the 337 Flag-H6, it was found that this does not interfere with the mechanisms regulating Tax-1 localization and function. It was also found that 337 Flag-H6 presented a nuclear localization and was adequately functional. Using this expression system allowed to show that also Tax-2 is located in specific nuclear complexes that are similar, but not identical, to the nuclear bodies (NB) formed by Tax-1 and that their expression is responsible for a specific accumulation of RelA NFKB factor at nuclear level. In conclusion, this study has allowed further understanding of the crossinteraction between HTLV-2 and HIV in coinfected subjects, and has given new important clues on the problem of cellular distribution and function of Tax-1 and Tax-2. The complex mechanisms that are responsible for the pleiotropic activities of the two proteins will be further clarified in the future by investigating their post-translational modifications.
2008
cellule; oncoproteina Tax; virus leucemogeni
L’attività di ricerca svolta in questa tesi ha riguardato due diversi progetti. Il primo concerne il problema della coinfezione da parte del retrovirus HTLV-2 di soggetti tossicodipendenti italiani che sono infettati da HIV-1, allo scopo di comprendere l’interazione tra i due retrovirus a livello cellulare e stabilire quale possa essere l’effetto sulla progressione dell’AIDS. Il secondo è centrato sullo studio e della funzione delle proteine Tax di HTLV-1 (Tax-1) e HTLV-2 (Tax-2) e sulla caratterizzazione, mediante mutagenesi, dei domini proteici specifici che modulano la funzione stessa. Il primo progetto ha comportato la messa a punto di analisi di PCR quantitativa e la determinazione del carico provirale di HTLV-2 in diversi soggetti infettati e la caratterizzazione molecolare degli isolati di HTLV-2. Dalle analisi compiute sulla popolazione coinfettata e monoinfettata da HIV-1 è risultato che il numero di pazienti “long-term non progressors” verso l’ AIDS è significativamente più alto nel gruppo dei coinfetti HIV-1/HTLV-2 rispetto a quello dei monoinfetti HIV-1. Questi dati indicano chiaramente che HTLV-2 ha un effetto protettivo contro la progressione dell’AIDS. Nel gruppo dei soggetti coinfettati da HIV-1/HTLV-2 sono stati seguiti 5 pazienti sottoposti a terapia antiretrovirale per HIV-1 ed è stato riscontrato un significativo aumento del carico provirale di HTLV-2 e un concomitante decremento in viremia HIV-1 in seguito al trattamento. Questi dati suggeriscono che la terapia antivirale contro l’HIV-1 è inefficace a contenere l’infezione da HTLV-2. La prima parte del secondo progetto ha riguardato l’analisi della localizzazione di Tax-2. A tal fine, il gene tax-2 è stato clonato in un vettore di espressione per cellule di mammifero, aggiungendo in frame all’estremità Cterm la “Green Fluorescent protein” (GFP). L’espressione transiente in cellule HeLa e 293T e la rilevazione tramite microscopia a fluorescenza hanno evidenziato una distribuzione citoplasmatica della proteina in forma punteggiata. Lo stesso procedimento è stato eseguito su mutanti della stessa proteina troncata progressivamente all’estremità C-term e fusa con GFP: 331-GFP, 156- GFP, 115-GFP, 60-GFP. Le immagini al microscopio a fluorescenza hanno confermato una localizzazione di Tax-2 a livello citoplasmatico, ad eccezione del clone 60-GFP, il quale risulta esclusivamente nucleare. L’ulteriore riduzione della proteina ai primi 33 aa mostra una distribuzione della fluorescenza diffusa a tutta la cellula, simile a quella ottenut a dall’espressione della sola proteina GFP. Questi dati confermano la presenza di un “nuclear localization determinant” (NLD) nei primi 60 aa della proteina. Al fine di caratterizzare più precisamente questa parte di Tax-2, sono stati analizzati numerosi mutanti per piccole delezioni aminoacidiche sul clone 60-GFP. Tutti i cloni analizzati, ad eccezione di quello che presenta la delezione 17-20, hanno mostrato una localizzazione nucleare, indicando che mutazioni puntiformi non sono in grado di perturbare la funzionalità del NLD. È stato possibile infine circoscrivere ulteriormente il NLD agli aa 1-41 in quanto, togliendo i primi 21 aa, si riscontra la perdita di funzionalità del NLD stesso. La seconda parte del progetto, riguardante la funzione della proteina Tax, è stata centrata sull’analisi comparativa della localizzazione cellulare di Tax-1 e Tax-2. Per fare questo sono stati clonati i geni tax-1 e tax-2 aggiungendo in frame all’estremità C-term delle proteine dei tag di diverso tipo: la GFP, la Yellow Fluorescent Protein (YFP) (~27 KDa), la proteina Halo (~30 KDa) ed una sequenza aminoacidica di 32 aa contenente l’epitopo V5 (~3 KDa). I cloni di Tax-1, -GFP, -YFP, -Halo e -V5 hanno mostrato una localizzazione prevalentemente nucleare, mentre i cloni di Tax-2, -GFP, -YFP e -Halo sono risultati prevalentemente citoplasmatici. Quando Tax-2 è stata clonata ed espressa con un tag di minor dimensioni quale V5, si è ottenuta una localizzazione prevalentemente nucleare. Questi risultati hanno permesso di dimostrare che l’utilizzo di tag di diverse dimensioni può modulare diversamente la localizzazione delle due proteine, in particolar modo Tax-2. Per identificare le regioni delle due proteine coinvolte nella regolazione della localizzazione cellulare, sono stati fatti esprimere mutanti sia di Tax-1 che di Tax-2 progressivamente troncati all’estremità C-term e fusi con il tag V5. Mettendo a confronto le immagini al microscopio confocale di questi mutanti è stata osservata una distribuzione cellulare molto simile per Tax-1 e Tax-2, anche nelle rispettive forme troncate: prevalentemente nucleari per Tax-1 e Tax-2 “full-length”e per la forma 1-340 e nucleo-citoplasmatiche per gli altri mutanti troncati di dimensioni inferiori. Data la mancanza di un anticorpo specifico contro Tax-2, è necessario di utilizzare sistemi tag per l’espressione ed il riconoscimento di Tax-2 all’interno della cellula per studiarne la localizzazione. Questo ha messo in evidenza che quest’ultima è particolarmente suscettibile alle modificazioni apportate dall’aggiunta di tag in posizione N-term e C-term. Per ovviare a questo problema, si è deciso di preparare costrutti di espressione per Tax-1 e Tax-2 inserendo il tag Flag-H6 all’interno della molecola proteica, tra gli aminoacidi 337 e 338 delle due proteine. Mettendo a confronto la localizzazione di Tax-1 nativa senza tag e quella di Tax-1 utilizzando il tag Flag-H6 in posizione 337, si è visto che questo ultimo non interferisce sui meccanismi che regolano la localizzazione di Tax-1. È stato inoltre possibile stabilire anche per Tax-2 che il tag Flag-H6 posto in posizione 337 permette una corretta lo calizzazione della proteina a livello nucleare. Utilizzando questo sistema di espressione è stato possibile mettere in evidenza alcune caratteristiche funzionali di Tax-2 che non erano ancora state dimostrate. Si è visto infatti che Tax-2 si localizza in modo specifico in strutture nucleari simili ai nuclear bodies (NB) tipici di Tax-1 e che la sua espressione è in grado di determinare un accumulo specifico del fattore RelA di NFKB a livello nucleare nelle stesse strutture. In conclusione questo studio ha permesso di chiarire l’interazione tra HTLV-2 and HIV in soggetti coinfettati ed ha prodotto nuove importanti informazioni sul problema della distribuzione cellulare di Tax-1 e Tax2. Il complesso meccanismo responsabile dell’attività pleiotropica delle due proteine potrà essere chiarito in futuro mediante un'analisi appropriata delle loro modificazioni post-traduzionali
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Tesi di Dottorato Marco Turci.pdf

non disponibili

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Accesso ristretto
Dimensione 2.76 MB
Formato Adobe PDF
2.76 MB Adobe PDF   Visualizza/Apri   Richiedi una copia

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11562/337631
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact