L’AIDS costituisce ancora a tutt’oggi un’emergenza sanitaria mondiale e nessuna cura in grado di eradicare questa malattia è stata ancora messa a punto. La comunicazione recente di clamorosi insuccessi di trial clinici su candidati vaccinali contro il virus HIV-1 hanno messo ancor più in evidenza la necessità di sviluppare nuovi immunogeni in grado di stimolare una risposta immunitaria umorale contro epitopi conservati delle proteine virali. HIV-1 infetta le cellule ospiti attraverso un meccanismo di fusione delle membrane virali e delle cellule target. Durante questo processo vengono esposti epitopi conservati della glicoproteina gp120/gp41 che possono essere utilizzati come possibili bersagli per l’induzione di anticorpi contro HIV-1. Nella prima parte della tesi sono stati studiati i complessi di fusione tra le proteine virali gp120/gp41 ed i recettori CD4 e CCR5. I complessi sono stati preparati cocoltivando cellule stabilmente trasfettate per queste molecole a diverse temperature (21°, 30°, 37° C), corrispondenti a differenti intermedi strutturali nel processo di fusione membranaria, e stabilizzati mediante l’uso di diversi fissativi (paraformaldeide, formaldeide, glutaraldeide, bis-sulfosuccinimidil-suberato). Sono stati immunizzati direttamente gruppi di topi con questi complessi di fusione per verificare la loro capacità di elicitare anticorpi neutralizzanti specifici. Gli splenociti murini prelevati dai topi che avevano evidenziato risposta anticorpale sono stati inoltre immortalizzati per essere poi testati per la produzione di anticorpi monoclonali neutralizzanti HIV-1. I risultati ottenuti indicano che: 1) i complessi di fusione sono immunogenici e sono in grado di indurre anticorpi neutralizzanti contro gli isolati eterologhi R5 ed X4 tropici di HIV-1; 2) l’estensiva purificazione degli anticorpi permette la rimozione di contaminati citotossici aspecifici; 3) i complessi preparati ad elevate temperature risultano maggiormente immunogenici ed inducono anticorpi neutralizzanti a titoli elevati; 4) l’attività neutralizzante viene mantenuta dopo rimozione della reattività contro le molecole CD4 e CCR5; 6) i valori di neutralizzazione virale non risultano direttamente proporzionali alla reattività in vitro degli anticorpi contro le componenti purificate del complesso; 7) una elevata attività neutralizzante contro l’infezione di un ampio spettro di pseudovirus di HIV-1, si ritrova nel sovranatante degli ibridomi prodotti. La produzione e la caratterizzazione di nuovi anticorpi monoclonali neutralizzanti potrà rivelarsi molto utile per identificare specifiche strutture immunogeniche ed epitopi da impiegare come vaccini per indurre anticorpi neutralizzanti protettivi a largo spettro. Nella seconda parte della tesi è stato affrontato lo studio del ruolo della catena HLAC del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I, acquisita da HIV-1 durante la gemmazione dalla membrana della cellula ospite o presente normalmente sulle cellule infettate, sull’infettività del virus. È noto che HLA-C è in grado di incrementare l’infettività di molti ceppi di HIV-1 riducendone così la suscettibilità all’azione degli anticorpi neutralizzanti. Al fine di comprendere il meccanismo che sta alla base di questo effetto, l’espressione dell’HLA-C è stata specificamente silenziata, mediante RNA interference, in diverse linee cellulari umane esprimenti proteine gp120/gp41 degli isolati virali ADA, LAI ed NDK. È stato così dimostrato che l’efficienza di fusione delle cellule silenziate viene significativamente ridotta (p<0,01), rispetto alle cellule non silenziate, quando sono co-coltivate con diverse cellule target che esprimono i recettori cellulari umani CD4, CCR5 e CXCR4. Questi risultati indicano che la mancanza di HLA-C riduce l’efficienza di fusione sia di ceppi X4 che R5 tropici di HIV-1. Invece, nei modelli che impiegano cellule di origine non umana, si osserva che la co-espressione di differenti isolati di env con HLA-C incrementa in modo significativo (p<0,01) l’efficienza di fusione con cellule target rispetto le stesse cellule prive di HLA-C. Pseudovirus prodotti su cellule 293T silenziate o meno per l’espressione di HLA-C hanno evidenziato una riduzione significativa (p<0,0001) dell’infettività rispetto a pseudovirus prodotti su cellule non silenziate. Questo modello di infezione ha permesso inoltre l’analisi dettagliata della eventuale dipendenza dalla dose infettante del fenotipo HLA-C dipendente. Tuttavia, molecole di gp120/gp41 ottenute dagli isolati virali NDK e J500 dimostrano una minor dipendenza dalla presenza della molecola HLA-C quando sono co-espresse, confermando precedenti risultati ottenuti sugli stessi isolati virali. A basse dosi infettanti si evidenzia comunque che i virus pseudotipizzati con env del ceppo NDK acquisiscono una maggiore infettività in presenza di HLA-C. Il silenziamento dell’espressione della molecola HLA-C sulle cellule che esprimono i recettori cellulari per HIV-1 (CD4, CCR5 and CXCR4) ha evidenziato una diminuzione sia dell’efficienza di fusione che della possibilità di essere infettate da pseudovirus prodotti con tutti i ceppi di env testati. I risultati mettono in evidenzia che esiste un differente ruolo e meccanismo d’azione di HLA-C in base alle molecole con cui si trova associata. Si è dimostrato inoltre che molecole di HLA-C possono essere purificate e rivelate in maniera specifica in complessi di fusione preparati co-coltivando cellule effettrici o target che la esprimono. I dati ottenuti indicano inoltre che la conformazione di HLA-C responsabile dell’aumento dell’efficienza di fusione è quella associata alla !2- microglobulina. La catena di HLA-C potrebbe stabilizzare i trimeri di gp120/gp41 e il complesso di fusione aumentandone l’efficienza di formazione e i cambiamenti conformazionali incrementando l’esposizione dei siti di legame per il recettore e/o i co-recettori sulla gp120. In alternativa, HLA-C potrebbe incrementare il numero di molecole di gp120 espresse sulla superficie cellulare/virale riducendone il distacco dalla gp41 e aumentando l’efficienza del processo di fusione delle membrane, così da far crescere l’infettività delle particelle virali. La presenza di anticorpi allogenici anti HLA-C potrebbe avere un effetto positivo sulla riduzione dell’infettività di HIV-1 anche di quei ceppi (come NDK) con un fenotipo apparentemente meno dipendente dalla presenza di HLA-C, riducendone così il rischio di trasmissione ed incrementando il livello di protezione. L’inclusione di molecole di HLA-C in complessi di fusione potrebbe avere importanti implicazioni nello sviluppo di nuovi immunogeni in grado di indurre una risposta anticorpale ad ampio spettro contro HIV-1.

AIDS is still representing a pandemic emergency and no cure has yet been found to eradicate it. The recently reported unsuccessful HIV-1 vaccine trials, point to the need of developing new immunogens capable of stimulating humoral immune response towards highly conserved viral epitopes. HIV-1 infects host cells by cellular/viral membrane fusion. During this process, conserved epitopes are exposed on the viral glycoprotein gp120/41 that may provide to be very useful as targets for the induction of antibodies against HIV-1. The study of the formation of fusion complexes between viral gp120/gp41 and cellular CD4-CCR5 molecules has been reported in the first part of this thesis. These complexes were prepared by co-cultivating stably transfected cells at different temperatures (21°, 30°, 37° C), corresponding to intermediate stages of the membrane fusion process, and stabilized using different fixatives (paraformaldehyde, formaldehyde, glutaraldehyde, bis-sulfosuccinimidyl-suberate). Mice were immunized with these fusion complexes to reveal the induction of HIV-1 neutralizing antibodies and murine spleenocytes obtained from immunized mice were used to generate hybridoma clones to be tested for the production of neutralizing monoclonal antibodies. The results obtained indicate that: 1) fusion complexes were immunogenic and induced neutralizing antibodies against R5 and X4 HIV-1 heterologous isolates; 2) extensive purification of antibodies allowed the removal of any unspecific cytotoxic effect; 3) complexes prepared at higher temperatures were more immunogenic and induced higher titers of neutralizing antibodies; 4) titer of neutralizing antibodies was not affected by the fixative used; 5) neutralizing activity was retained after CD4-CCR5 antibody removal; 6) viral neutralization is not directly proportional to the in vitro antibody reactivity against complex purified components; 7) high and broad neutralizing activity against HIV-1 env pseudotyped viruses can be isolated in hybridoma supernatants. The production and characterization of new neutralizing monoclonal antibodies will be useful to identify specific immunogenic structures and epitopes to be used as anti HIV-1 vaccine to induce broad protecting neutralizing antibodies, when administered in a suitable delivery system. The second part of this thesis was focused on the role of host-cell HLA-C chain, acquired by HIV-1 during budding or normally expressed on target cells, during membrane fusion process. It was alredy reported that HLA-C presence enhances the infectivity of many HIV-1 strains and can reduce their susceptibility to neutralizing antibodies. To further understand this mechanism, HLA-C expression was selectively silenced, using the RNA interference technique, in different human cell lines expressing HIV-1 gp120/gp41 of the laboratory strains ADA, LAI and NDK. The fusion efficiency of HLA-C silenced cells was found to be significantly reduced (p<0,01) compared to non-silenced cells when co-cultivated with different target cell lines expressing HIV-1 receptor CD4 and co-receptors CCR5 and/or CXCR4. This observation suggests that HLA-C silencing reduces the fusion efficiency of the gp120/gp41 of many HIV-1 R5 and X4 tropic HIV-1 strains. Conversely, in nonhuman cells, the co-expression of several primary HIV-1 env genes with HLA-C increases significantly (p<0,01) the fusion efficiency with target cells in comparison to cells lacking HLA-C expression. When HIV-1 env pseudotyped viruses were produced in HLA-C silenced 293T cells, a significant reduction (p<0,0001) in their infectivity was observed as compared to HLA-C bearing pseudoviruses. Furthermore, infectivity assays allowed a more detailed analysis of dose dependence of HLA-C sensitive phenotype. However, HIV-1 gp120/gp41 of laboratory strains NDK and J500 appear to be less sensitive to HLA-C presence when co-expressed, in agreement to previous study on viral isolates. In addition, when a lower infectious dose was used, the NDK pseudotyped virus became more sensitive to HLA-C presence. The silencing of HLA-C expression on cells expressing HIV-receptors (CD4, CCR5 and CXCR4) resulted in a decreased fusogenic and infection activity (p<0,0001) with all Env molecules tested, so the mechanism at the basis of HLA-C sensitivity appears to be different when associated to viral envelope or target cellular membrane. HLA-C molecules can be specifically co-purified and detected in fusion complexes when co-expressed with gp120/gp41 or HIV-receptors. Our data indicate that the HLAC conformation responsible for increasing fusion efficiency consists in the heavy " chain associated to the !2-microglobulin. The HLA-C molecule might be able to stabilize the trimeric gp120/gp41 and the fusion complex, by improving the efficiency of the conformational changes, thus enhancing the exposure of the receptor and/or co-receptor binding site on the gp120/gp41. Alternatively, HLA-C might increase the amounts of gp120 on the cell/viral surface, reducing the shedding from gp41 and boosting the efficiency of the fusion process resulting in a greater infectivity of viral particles. Understanding the role of HLA-C in HIV-1 infectivity may provide important new information for the development of an AIDS vaccine. The presence of circulating allogeneic anti-HLA-C antibodies might help in reducing viral infectivity, even for virus strains (as NDK) with an apparent HLA-C insensitivity and could result in a reduced transmission risk and ultimately in an increased protection. The addition of HLA-C molecules to fusion complexes might have potential important implications for the development of new immunogens to elicit broad spectrum HIV-1 neutralizing antibodies.

Studio di immunogeni per l'induzione di anticorpi neutralizzati ad ampio spettro contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1)

MATUCCI, Andrea
2008-01-01

Abstract

L’AIDS costituisce ancora a tutt’oggi un’emergenza sanitaria mondiale e nessuna cura in grado di eradicare questa malattia è stata ancora messa a punto. La comunicazione recente di clamorosi insuccessi di trial clinici su candidati vaccinali contro il virus HIV-1 hanno messo ancor più in evidenza la necessità di sviluppare nuovi immunogeni in grado di stimolare una risposta immunitaria umorale contro epitopi conservati delle proteine virali. HIV-1 infetta le cellule ospiti attraverso un meccanismo di fusione delle membrane virali e delle cellule target. Durante questo processo vengono esposti epitopi conservati della glicoproteina gp120/gp41 che possono essere utilizzati come possibili bersagli per l’induzione di anticorpi contro HIV-1. Nella prima parte della tesi sono stati studiati i complessi di fusione tra le proteine virali gp120/gp41 ed i recettori CD4 e CCR5. I complessi sono stati preparati cocoltivando cellule stabilmente trasfettate per queste molecole a diverse temperature (21°, 30°, 37° C), corrispondenti a differenti intermedi strutturali nel processo di fusione membranaria, e stabilizzati mediante l’uso di diversi fissativi (paraformaldeide, formaldeide, glutaraldeide, bis-sulfosuccinimidil-suberato). Sono stati immunizzati direttamente gruppi di topi con questi complessi di fusione per verificare la loro capacità di elicitare anticorpi neutralizzanti specifici. Gli splenociti murini prelevati dai topi che avevano evidenziato risposta anticorpale sono stati inoltre immortalizzati per essere poi testati per la produzione di anticorpi monoclonali neutralizzanti HIV-1. I risultati ottenuti indicano che: 1) i complessi di fusione sono immunogenici e sono in grado di indurre anticorpi neutralizzanti contro gli isolati eterologhi R5 ed X4 tropici di HIV-1; 2) l’estensiva purificazione degli anticorpi permette la rimozione di contaminati citotossici aspecifici; 3) i complessi preparati ad elevate temperature risultano maggiormente immunogenici ed inducono anticorpi neutralizzanti a titoli elevati; 4) l’attività neutralizzante viene mantenuta dopo rimozione della reattività contro le molecole CD4 e CCR5; 6) i valori di neutralizzazione virale non risultano direttamente proporzionali alla reattività in vitro degli anticorpi contro le componenti purificate del complesso; 7) una elevata attività neutralizzante contro l’infezione di un ampio spettro di pseudovirus di HIV-1, si ritrova nel sovranatante degli ibridomi prodotti. La produzione e la caratterizzazione di nuovi anticorpi monoclonali neutralizzanti potrà rivelarsi molto utile per identificare specifiche strutture immunogeniche ed epitopi da impiegare come vaccini per indurre anticorpi neutralizzanti protettivi a largo spettro. Nella seconda parte della tesi è stato affrontato lo studio del ruolo della catena HLAC del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I, acquisita da HIV-1 durante la gemmazione dalla membrana della cellula ospite o presente normalmente sulle cellule infettate, sull’infettività del virus. È noto che HLA-C è in grado di incrementare l’infettività di molti ceppi di HIV-1 riducendone così la suscettibilità all’azione degli anticorpi neutralizzanti. Al fine di comprendere il meccanismo che sta alla base di questo effetto, l’espressione dell’HLA-C è stata specificamente silenziata, mediante RNA interference, in diverse linee cellulari umane esprimenti proteine gp120/gp41 degli isolati virali ADA, LAI ed NDK. È stato così dimostrato che l’efficienza di fusione delle cellule silenziate viene significativamente ridotta (p<0,01), rispetto alle cellule non silenziate, quando sono co-coltivate con diverse cellule target che esprimono i recettori cellulari umani CD4, CCR5 e CXCR4. Questi risultati indicano che la mancanza di HLA-C riduce l’efficienza di fusione sia di ceppi X4 che R5 tropici di HIV-1. Invece, nei modelli che impiegano cellule di origine non umana, si osserva che la co-espressione di differenti isolati di env con HLA-C incrementa in modo significativo (p<0,01) l’efficienza di fusione con cellule target rispetto le stesse cellule prive di HLA-C. Pseudovirus prodotti su cellule 293T silenziate o meno per l’espressione di HLA-C hanno evidenziato una riduzione significativa (p<0,0001) dell’infettività rispetto a pseudovirus prodotti su cellule non silenziate. Questo modello di infezione ha permesso inoltre l’analisi dettagliata della eventuale dipendenza dalla dose infettante del fenotipo HLA-C dipendente. Tuttavia, molecole di gp120/gp41 ottenute dagli isolati virali NDK e J500 dimostrano una minor dipendenza dalla presenza della molecola HLA-C quando sono co-espresse, confermando precedenti risultati ottenuti sugli stessi isolati virali. A basse dosi infettanti si evidenzia comunque che i virus pseudotipizzati con env del ceppo NDK acquisiscono una maggiore infettività in presenza di HLA-C. Il silenziamento dell’espressione della molecola HLA-C sulle cellule che esprimono i recettori cellulari per HIV-1 (CD4, CCR5 and CXCR4) ha evidenziato una diminuzione sia dell’efficienza di fusione che della possibilità di essere infettate da pseudovirus prodotti con tutti i ceppi di env testati. I risultati mettono in evidenzia che esiste un differente ruolo e meccanismo d’azione di HLA-C in base alle molecole con cui si trova associata. Si è dimostrato inoltre che molecole di HLA-C possono essere purificate e rivelate in maniera specifica in complessi di fusione preparati co-coltivando cellule effettrici o target che la esprimono. I dati ottenuti indicano inoltre che la conformazione di HLA-C responsabile dell’aumento dell’efficienza di fusione è quella associata alla !2- microglobulina. La catena di HLA-C potrebbe stabilizzare i trimeri di gp120/gp41 e il complesso di fusione aumentandone l’efficienza di formazione e i cambiamenti conformazionali incrementando l’esposizione dei siti di legame per il recettore e/o i co-recettori sulla gp120. In alternativa, HLA-C potrebbe incrementare il numero di molecole di gp120 espresse sulla superficie cellulare/virale riducendone il distacco dalla gp41 e aumentando l’efficienza del processo di fusione delle membrane, così da far crescere l’infettività delle particelle virali. La presenza di anticorpi allogenici anti HLA-C potrebbe avere un effetto positivo sulla riduzione dell’infettività di HIV-1 anche di quei ceppi (come NDK) con un fenotipo apparentemente meno dipendente dalla presenza di HLA-C, riducendone così il rischio di trasmissione ed incrementando il livello di protezione. L’inclusione di molecole di HLA-C in complessi di fusione potrebbe avere importanti implicazioni nello sviluppo di nuovi immunogeni in grado di indurre una risposta anticorpale ad ampio spettro contro HIV-1.
immunogeni; immunodeficienza umana; hiv
AIDS is still representing a pandemic emergency and no cure has yet been found to eradicate it. The recently reported unsuccessful HIV-1 vaccine trials, point to the need of developing new immunogens capable of stimulating humoral immune response towards highly conserved viral epitopes. HIV-1 infects host cells by cellular/viral membrane fusion. During this process, conserved epitopes are exposed on the viral glycoprotein gp120/41 that may provide to be very useful as targets for the induction of antibodies against HIV-1. The study of the formation of fusion complexes between viral gp120/gp41 and cellular CD4-CCR5 molecules has been reported in the first part of this thesis. These complexes were prepared by co-cultivating stably transfected cells at different temperatures (21°, 30°, 37° C), corresponding to intermediate stages of the membrane fusion process, and stabilized using different fixatives (paraformaldehyde, formaldehyde, glutaraldehyde, bis-sulfosuccinimidyl-suberate). Mice were immunized with these fusion complexes to reveal the induction of HIV-1 neutralizing antibodies and murine spleenocytes obtained from immunized mice were used to generate hybridoma clones to be tested for the production of neutralizing monoclonal antibodies. The results obtained indicate that: 1) fusion complexes were immunogenic and induced neutralizing antibodies against R5 and X4 HIV-1 heterologous isolates; 2) extensive purification of antibodies allowed the removal of any unspecific cytotoxic effect; 3) complexes prepared at higher temperatures were more immunogenic and induced higher titers of neutralizing antibodies; 4) titer of neutralizing antibodies was not affected by the fixative used; 5) neutralizing activity was retained after CD4-CCR5 antibody removal; 6) viral neutralization is not directly proportional to the in vitro antibody reactivity against complex purified components; 7) high and broad neutralizing activity against HIV-1 env pseudotyped viruses can be isolated in hybridoma supernatants. The production and characterization of new neutralizing monoclonal antibodies will be useful to identify specific immunogenic structures and epitopes to be used as anti HIV-1 vaccine to induce broad protecting neutralizing antibodies, when administered in a suitable delivery system. The second part of this thesis was focused on the role of host-cell HLA-C chain, acquired by HIV-1 during budding or normally expressed on target cells, during membrane fusion process. It was alredy reported that HLA-C presence enhances the infectivity of many HIV-1 strains and can reduce their susceptibility to neutralizing antibodies. To further understand this mechanism, HLA-C expression was selectively silenced, using the RNA interference technique, in different human cell lines expressing HIV-1 gp120/gp41 of the laboratory strains ADA, LAI and NDK. The fusion efficiency of HLA-C silenced cells was found to be significantly reduced (p<0,01) compared to non-silenced cells when co-cultivated with different target cell lines expressing HIV-1 receptor CD4 and co-receptors CCR5 and/or CXCR4. This observation suggests that HLA-C silencing reduces the fusion efficiency of the gp120/gp41 of many HIV-1 R5 and X4 tropic HIV-1 strains. Conversely, in nonhuman cells, the co-expression of several primary HIV-1 env genes with HLA-C increases significantly (p<0,01) the fusion efficiency with target cells in comparison to cells lacking HLA-C expression. When HIV-1 env pseudotyped viruses were produced in HLA-C silenced 293T cells, a significant reduction (p<0,0001) in their infectivity was observed as compared to HLA-C bearing pseudoviruses. Furthermore, infectivity assays allowed a more detailed analysis of dose dependence of HLA-C sensitive phenotype. However, HIV-1 gp120/gp41 of laboratory strains NDK and J500 appear to be less sensitive to HLA-C presence when co-expressed, in agreement to previous study on viral isolates. In addition, when a lower infectious dose was used, the NDK pseudotyped virus became more sensitive to HLA-C presence. The silencing of HLA-C expression on cells expressing HIV-receptors (CD4, CCR5 and CXCR4) resulted in a decreased fusogenic and infection activity (p<0,0001) with all Env molecules tested, so the mechanism at the basis of HLA-C sensitivity appears to be different when associated to viral envelope or target cellular membrane. HLA-C molecules can be specifically co-purified and detected in fusion complexes when co-expressed with gp120/gp41 or HIV-receptors. Our data indicate that the HLAC conformation responsible for increasing fusion efficiency consists in the heavy " chain associated to the !2-microglobulin. The HLA-C molecule might be able to stabilize the trimeric gp120/gp41 and the fusion complex, by improving the efficiency of the conformational changes, thus enhancing the exposure of the receptor and/or co-receptor binding site on the gp120/gp41. Alternatively, HLA-C might increase the amounts of gp120 on the cell/viral surface, reducing the shedding from gp41 and boosting the efficiency of the fusion process resulting in a greater infectivity of viral particles. Understanding the role of HLA-C in HIV-1 infectivity may provide important new information for the development of an AIDS vaccine. The presence of circulating allogeneic anti-HLA-C antibodies might help in reducing viral infectivity, even for virus strains (as NDK) with an apparent HLA-C insensitivity and could result in a reduced transmission risk and ultimately in an increased protection. The addition of HLA-C molecules to fusion complexes might have potential important implications for the development of new immunogens to elicit broad spectrum HIV-1 neutralizing antibodies.
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