Criteri funzionali e di sicurezza per la valutazione di batteri lattici e lieviti da impiegare nella produzione di alimenti fermentati e come probiotici

Negli ultimi anni si è assistito a una crescente domanda da parte dei consumatori dei paesi industrializzati di alimenti che siano in grado non solo di soddisfare le esigenze nutrizionali e che si rivelino sicuri dal punto di vista igienico-sanitario, ma che rispondano anche a requisiti di tipicità e qualità dal punto di vista sensoriale e/o contengano probiotici o metaboliti microbici con effetti positivi sulla salute. Tali alimenti, che sono riconosciuti di “alta qualità”, presentano un elevato valore aggiunto e focalizzano l’attenzione dei settori dell’industria alimentare più attenti all’evoluzione delle produzioni tradizionali e allo sviluppo di prodotti innovativi con potenzialità di crescita in nuovi segmenti di mercato. Attualmente, grazie alle acquisizioni conoscitive e agli strumenti metodologici più recenti e avanzati derivanti dalla biotecnologia e dalla biologia molecolare è possibile condurre un’attività di ricerca che approfondisca lo studio dei microrganismi responsabili delle trasformazioni coinvolte nella produzione di questi alimenti e che permetta di utilizzarli in modo mirato al fine di rispondere alle richieste dei consumatori e della moderna industria alimentare. In tale contesto, si inserisce questo progetto di dottorato dal titolo “Criteri funzionali e di sicurezza per la valutazione di batteri lattici e lieviti da impiegare nella produzione di alimenti fermentati e come probiotici” che si è posto l’obiettivo di individuare nuove colture di batteri lattici (Lactic Acid Bacteria, LAB) e lieviti dotate di specifiche caratteristiche tecnologiche, salutistiche e di sicurezza idonee per ottenere prodotti fermentati di elevata qualità. Il lavoro ha previsto la selezione e l’analisi di microrganismi autoctoni a partire da prodotti fermentati ottenuti senza l’uso di starter. L’attenzione è stata rivolta in particolare a due importanti gruppi di alimenti fermentati quali i prodotti lattiero-caseari e il vino. Infatti, questi prodotti sono fortemente influenzati dalle popolazioni microbiche che in essi sviluppano e che ampiamente ne condizionano i processi di preparazione e la qualità. Pertanto queste matrici fermentate spontaneamente possono essere fonte di ceppi microbici fra i quali possono essere selezionate colture starter, colture protettive o di supporto e colture probiotiche, tecnologicamente e funzionalmente molto utili. Per studiare la biodiversità e le caratteristiche genotipiche e fenotipiche dei ceppi isolati sono stati considerati diversi criteri biotecnologici innovativi. Questi, infatti, insieme ai parametri tradizionalmente considerati ai fini della selezione di colture microbiche, possono evidenziare la presenza di proprietà tecnologiche e/o funzionali in grado di apportare miglioramenti qualitativi e, quindi, un certo valore aggiunto ai prodotti finali. La prima parte della tesi (capitoli 2 e 3) è stata dedicata allo studio di LAB di origine lattierocasearia e di un ceppo probiotico. In particolare il capitolo 2 riguarda le attività condotte nell’ambito di un progetto finalizzato alla conservazione, caratterizzazione e valorizzazione della microflora lattica presente nei formaggi prodotti nelle malghe della Val Venosta. La ricerca ha previsto lo screening di 359 isolati da matrici lattierocasearie per alcune proprietà tecnologiche ritenute importanti nell’individuazione di ceppi da impiegare come starter, come l’attività proteolitica e la capacità di coagulare e acidificare il latte. Tra le proprietà funzionali è stata ricercata l’attività antagonistica verso alcuni microrganismi indesiderati in quanto patogeni o perché causa di difetti. Queste indagini preliminari hanno permesso di selezionare un centinaio di isolati sui quali è stata eseguita un’ulteriore caratterizzazione fisiologica per verificare la capacità dei ceppi di sviluppare in formaggio, dove possono esplicare le loro attività biochimiche, e di resistere nel tratto gastrointestinale dell’uomo, requisito fondamentale per definire un microrganismo probiotico. Questi test hanno permesso di individuare una trentina di isolati che sono stati identificati a livello di specie e ceppo attraverso l’uso di alcune tecniche molecolari e nei quali è stata verificata la presenza di geni portatori di caratteristiche indesiderate, come le anitibiotico resistenze e la capacità di produrre amine biogene. Le proprietà antagonistiche sono state approfondite per gli enterococchi e i lattococchi, indagando la presenza di geni codificanti per le batteriocine note più diffuse in questi microrganismi. Le particolari proprietà tecnologiche e funzionali rilevate in laboratorio per un ceppo di Lactococcus lactis subsp. lactis sono state, inoltre, validate con prove di microcaseificazione. Buona parte degli isolati appartenenti alle specie casearie più interessanti sono stati, inoltre, testati per la capacità di produrre sostanze inibitrici dell’Angiotensin I-converting enzyme (EC 3.4.15.1) (ACE), enzima chiave nella regolazione della pressione sanguigna negli animali, incluso l’uomo. La presenza di inibitori dell’ACE è stata testata dopo crescita in latte tramite un saggio spettrofotometrico. Alcuni ceppi di Lactobacillus casei sono risultati positivi al test. Lo studio ha previsto, inoltre, la ricerca del gene prt, codificante per una proteinasi identificata in Lactobacillus helveticus CP790, probabilmente coinvolta nella produzione di peptidi bioattivi. Il capitolo 3 riporta i risultati di uno studio relativo alla somministrazione di un ceppo probiotico (Lactobacillus acidophilus D2/CSL) in un allevamento di polli da carne. Questo microrganismo è, attualmente, registrato a livello europeo per l’uso nel settore delle galline ovaiole, ma non ancora nel settore del pollo da carne. Il ceppo è stato distribuito agli animali attraverso l’acqua di abbeveraggio utilizzando un sistema dosatore automatico. Due prove, hanno previsto l’impiego di polli trattati con anticoccidi attraverso il mangime, mentre in una ulteriore sperimentazione sono stati utilizzati animali precedentemente vaccinati. I due gruppi di polli, trattato e controllo, erano allocati in due capannoni uguali e adiacenti. Gli effetti del trattamento sono stati verificati attraverso la misura della crescita dei polli come peso medio, il calcolo degli indici di efficienza biologica (indice di conversione e di performance) e la mortalità. I dati elaborati statisticamente hanno evidenziato un’elevata significatività delle differenze riscontrate tra i polli trattati e i polli controllo. L’analisi microbiologica del contenuto del gozzo e dell’intestino, invece, non ha messo in evidenza differenze importanti a causa dell’elevata eterogeneità presente tra i campioni dello stesso gruppo e la scarsità di numero degli animali sacrificati. La seconda parte della tesi (capitoli 4 e 5), invece, ha trattato lo studio di microrganismi (lieviti e batteri) di origine enologica al fine di selezionarne alcuni idonei ad essere proposti come starter o colture di supporto, in quanto in grado di esaltare la tipicità dei vitigni autoctoni presenti nella regione Veneto. È riconosciuto, infatti, che i ceppi oggi presenti sul mercato limitano l’espressione delle caratteristiche del territorio essendo il risultato di programmi di selezione condotti su diversi terroir. Oggetto del capitolo 4 è lo studio condotto su 37 ceppi di Oenococcus oeni precedentemente isolati da vini in fermentazione malolattica (FML) spontanea. La ricerca ha previsto inizialmente la verifica della sicurezza dei ceppi per quanto riguarda la loro capacità di produrre sostanze tossiche, quali le amine biogene e l’etilcarbammato; in seguito è stata indirizzata alla valutazione dell’attività b- glucosidasica dei ceppi. Questa capacità, infatti, riveste un ruolo importante, in quanto coinvolta nella liberazione di aromi a partire dai loro precursori glucosilati inodori e di resveratrolo, molecola naturalmente presente in forma glucosilata nella buccia dell'uva e ampiamente studiata per le sue attività antiossidanti e anticoagulanti, utili nella prevenzione di malattie cardiovascolari e della carcinogenesi. Il saggio enzimatico ha evidenziato che l’attività è legata alle cellule e più elevata nella tarda fase esponenziale di crescita. L’elevata variabilità intraspecifica ha permesso di operare una selezione dei ceppi più attivi. L’etanolo si è rivelato un forte inibitore per concentrazioni superiori al 10% mentre livelli inferiori hanno portato ad una stimolazione dell’attività ceppo-dipendente. I protocolli molecolari basati sulla PCR, sviluppati al fine di rilevare la presenza e l’espressione dei geni codificanti per l’enzima, hanno rilevato una bassa eterogeneità genetica anche se test di RT-PCR hanno riscontrato una certa variabilità nell’espressione, suggerendo una regolazione ceppo-specifica di fattori coinvolti nel processo di trascrizione dei geni. L’analisi finale ha previsto la quantificazione tramite analisi high pressure liquid chromatography (HPLC) del resveratrolo liberato dai ceppi di O. oeni selezionati in vino sintetico (SW), in due differenti tipi di vino rosso, Merlot e Recioto passito, e in vino bianco. Sono state allestite prove di microvinificazione e, alla fine della FML, è stata rilevata la presenza di resveratrolo solo in SW. Le complesse condizioni compositive e chimico-fisiche del vino probabilmente sono tali da influenzare negativamente l’attività b-glucosidasica dei ceppi di O. oeni. L’ultima parte di questo progetto di dottorato (capitolo 5) ha previsto la selezione di lieviti da impiegare come starter o colture aggiunte nella produzione di vini veneti. A partire da fermentazioni spontanee di mosti ottenuti da uve raccolte direttamente in campo e dallo sgrondo dei carri con cui è stata conferita l’uva in cantina sono stati isolati 529 lieviti. Su questi sono stati effettuati diversi test di caratterizzazione: alcuni volti all’individuazione di proprietà negative (produzione di idrogeno solforato e fenoli) e altri volti alla valutazione di proprietà desiderate, tra cui quelle coinvolte nella liberazione di aromi e nella stabilità dei vini. Particolare attenzione è stata dedicata allo studio di alcune caratteristiche innovative, quale per esempio l’attività glicosidasica. Un’altra importante caratteristica che è stata valutata nei lieviti è quella proteolitica, in quanto può contribuire alla stabilizzazione e alla chiarifica dei vini, evitando o riducendo fenomeni di intorbidimento. La caratterizzazione molecolare è stata eseguita utilizzando la tecnica pulsed field gel electrophoresis che è stata in grado di rilevare l’appartenenza degli isolati alla specie Saccharomyces cerevisiae, mettendo contemporaneamente in evidenza la presenza di cloni che sono stati esclusi dalle successive analisi. Successivamente, sono state condotte prove di microfermentazioni con gli 80 lieviti selezionati. I dati ottenuti hanno messo in evidenza una buona capacità fermentativa dei ceppi e le analisi condotte sui vini hanno permesso di selezionarne sette per le successive prove di vinificazione in cantina. Da queste è risultato particolarmente interessante un ceppo che ha prodotto un vino Valpolicella con caratteristiche sensoriali di pregio. In conclusione questa tesi di dottorato ha raccolto diversi progetti di ricerca nell’ambito della microbiologia alimentare che sono stati eseguiti utilizzando un approccio innovativo comune basato sull’applicazione di nuove metodologie d’indagine e considerando parametri di studio non convenzionali. Il lavoro ha permesso lo sviluppo di alcuni nuovi protocolli per la ricerca di caratteri funzionali desiderati e di tratti negativi da escludere nei microrganismi per la produzione di alimenti fermentati. I lavori di selezione condotti hanno messo in luce la ricchezza di biodiversità ancora presente nelle matrici fermentate naturalmente, che si sono rivelate una fonte di microrganismi di interesse per i loro potenziali effetti sulla qualità dei prodotti fermentati e sulla salute del consumatore. Quest’ultimo aspetto è stato, inoltre, verificato anche in ambito zootecnico, sottolineando l’importanza dell’impiego dei LAB anche in questo settore, in cui le problematiche legate all’uso degli antibiotici sono di enorme attualità e si riflettono, purtroppo, anche sulla salute dell’uomo. Di rilievo è stata, inoltre, l’individuazione di alcuni ceppi di LAB e lieviti di potenziale interesse industriale da poter impiegare nella produzione di alimenti fermentati tradizionali o innovativi di elevato pregio e di alta qualità.

Over the last years consumers from industrialized countries have become more and more demanding about foods which not only can satisfy nutritional and safety needs, but also assure sensorial peculiarity and quality, and/or that contain probiotics or microbial metabolites with positive effects on health. These foods, which are recognized as “high quality foods”, have a high added-value and focus the attention of food industry areas interested in the evolution of traditional products and in the development of novel ones, with a huge growing potential in new market segments. Nowadays, through knowledge breakthroughs and the latest advanced methods deriving from biotechnology and molecular biology, it is possible to carry out research for studying in depth microorganisms responsible for transformations during production of these foods, and to use them specifically for answering consumers and modern food industry demands. In this context, the aim of this PhD project titled “Functional and safety criteria for the evaluation of lactic acid bacteria and yeasts to use in the production of fermented foods and probiotics” was the individuation of new LAB (Lactic acid bacteria) and yeasts cultures having peculiar technological, healthy and safety characteristics suitable to obtain high quality fermented foods. The study deals with the selection and the analysis of autochthonous microorganisms from fermented foods obtained without starters. The attention was in particular focused on two important groups of fermented foods: dairy products and wine. These products are, in fact, strongly influenced by microbial populations growing in, which widely affect production processes and quality. Then, these spontaneously fermented matrices could be the source of microbial strains in which starter, protective, support and probiotic cultures, technologically and functionally very useful, can be identified. To study biodiversity and isolates’ genotypic and phenotypic properties, different innovative biotechnological criteria were considered. These criteria, indeed, with the traditional parameters examined for microbial strains selection, can highlight the presence of technological and/or functional properties able to improve quality and thus to provide an added value to final products. The first part of this thesis (chapters 2 and 3) was dedicated to the study of dairy LAB and of a probiotic strain. In detail, chapter 2 regards activities carried out in a project aimed at preservation, characterization and exploitation of lactic microflora in cheeses produced in Val Venosta “malga”. The research began with the screening of 359 dairy isolates for some technological properties, like proteolytic and milk coagulation and acidification activities, useful for the individuation of starters. Among functional properties, antagonistic activity toward some undesired pathogenic or food-spoiling microorganisms was investigated. These preliminary analyses allowed selecting about a hundred isolates on which further physiological characterization was conducted to verify their capability to grow in cheese, where they could perform their biochemical activities, and their resistance to human gastrointestinal tract, fundamental condition for defining a microorganism “probiotic”. These assays allowed to individuate about thirty isolates which were identified at species and strain levels by using some molecular techniques and in which the presence of genes codifying for undesired characteristics, like antibiotic resistances and biogenic amines production ability was verified. Antagonistic properties were further investigated, for enterococci and lactococci, assaying the presence of genes codifying the most spread bacteriocins in these microorganisms. The peculiar technological and functional traits detected in laboratory for a Lactococcus lactis subsp. lactis strain were validated in cheese-making trials. Moreover, most of the isolates belonging to the more interesting dairy species were assayed for their ability to produce compounds inhibiting the Angiotensin I-converting enzyme (EC 3.4.15.1) (ACE), a key enzyme involved in the regulation of blood pressure in animals, including humans. The presence of ACE inhibitors was tested after growth in milk by a spectrophotometric assay. Some Lactobacillus casei strains gave positive results. In this study the presence of the prt gene, codifying a proteinase, identified in Lactobacillus helveticus CP790 and probably involved in bioactive peptides production, was also examined. Chapter 3 reported the results of feeding a probiotic strain (Lactobacillus acidophilus D2/CSL) to broiler chickens. This microorganism is, nowadays, registered at European Community level for laying hens but needs authorization for broilers feeding. The strain was automatically dosed and administered to animals through water. In two trials, broilers received coccidiostats through the feed, while in the third trial chickens were previously vaccinated. Treated and control groups were allocated in two identical and adjacent barns. Treatment effects were verified by chicken growth detection like average weight gain, mortality and feed efficiency calculation (conversion and performance index). Statistically processed data showed significant differences between treated and control groups. Microbiological analysis of crop and intestine contents, instead, did not exhibit significant differences because of the high heterogeneity present between samples of the same group and the limited number of slaughtered animals. The second part of the thesis (chapter 4 and 5) deals with the study of microorganisms (yeasts and bacteria) of oenological origin, aimed at selecting some strains suitable to be proposed like starters or support cultures, for being able to exalt typicality of autochthonous vines present in the Veneto region. It is actually well-known that the strains present on the market limit the expression of the area peculiarities, because obtained from selection program carried out on different terroir. The object of chapter 4 is a study conducted on 37 Oenococcus oeni strains previously isolated from wines in spontaneous malolactic fermentation (MLF). The research began with the examination of the strains safety with respect to their ability to produce biogenic amines and ethylcarbamate; then their b- glucosidase activity was evaluated. This property is very important because it is involved in flavours release from their odourless glucosilated precursors, and in the production of resveratrol, a compound naturally present in the grape skin like glucosyl derivative and widely studied for its antioxidant and anticoagulation properties, effective against cardiovascular diseases and carcinogenesis. The enzymatic assay showed that activity was associated to whole cells and was higher in the late exponential growth phase. The high intra-species variability allowed to select the more active strains. Concentrations of ethanol over 10% strongly inhibited the enzyme, while lower values showed a stimulation of the straindependent activity. PCR-based molecular protocols, developed to detect the presence and the expression of genes codifying for this enzyme, found a low genetic heterogeneity, even if RT-PCR assays detected a moderate expression variability, suggesting a strain-specific regulation of factors involved in gene transcription process. The last analysis concerned the high pressure liquid chromatography (HPLC) quantification of resveratrol produced by the selected O. oeni strains in synthetic wine, in two different kinds of red wine, Merlot and Recioto passito, and in a white wine. Micro wine-making trials were carried out and, at the end of MLF, the resveratrol presence was detected only in synthetic wine. Probably, the complex composition and the chemical-physical conditions of wine negatively influence O. oeni strains’ b-glucosidase activity. The last part of this PhD project (chapter 5) concerned the selection of yeasts to be use like starter or added cultures in the production of Veneto region wines. From spontaneous alcoholic fermentations of musts, obtained from grapes directly collected in fields and from the dripping of farm trailers carrying grapes to the winery, 529 yeasts were isolated. Several characterization tests were done: some for the detection of undesired activities (sulphur hydroxide and phenols production) and some for the evaluation of desired properties, as those involved in the release of flavours and in the wine stability. Particular attention was dedicated to examine some innovative characteristics, like, for example, glycosidase activities. Another important assayed trait was the yeasts proteolytic activity that could contribute to the stabilization and the clarification of wines, avoiding or decreasing turbidity. Molecular characterization was performed by pulsed field gel electrophoresis, which was able to identify isolates as Saccharomyces cerevisiae and to detect the presence of clones, excluded from the next analyses. Afterwards, micro-fermentations trials with 80 selected strains were carried out. Collected data highlighted a good fermentative behaviour of the strains, and wines analysis allowed to select seven strains to test in winery wine-making trials. One strain from these trials was found very interesting, and produced a Valpolicella wine with good sensorial quality traits. In conclusion, this PhD thesis collected different research projects in food microbiology field, which were carried out using a common innovative approach based on the application of new investigation methodologies and on the examination of unconventional parameters. The work allowed the development of new protocols for the survey of functional properties and the search of negative traits to be excluded in microorganisms for fermented foods production. The performed selections highlighted the biodiversity richness in spontaneously fermented foods, which were identified as an interesting source of microorganisms for their potential effects on fermented products quality and on consumer health. This last consideration was also verified in the zootechnical field, underlining the importance of using LAB in this sector, in which issues associated to antibiotic use are currently of great interest and directly involve consumer health. The individuation of some LAB and yeasts, potentially interesting for industrial application as starters for the production of traditional and novel fermented food with high quality and value, was also very relevant.