Identification of triggering receptor expressed on myeloid cells (TREM)s ligands

I TREM (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells) sono una famiglia di recettori di membrana con funzione attivatoria e inibitoria, in base alla capacità di associare a DAP12 una proteina adattatrice o alla presenza di un dominio citoplasmatico contenente motivi ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif). I TREM sono espressi da granulociti, monociti, macrofagi, cellule dendritiche, microglia, osteoclasti e piastrine, cellule di origine mieloide coinvolte sia nella risposta immunitaria innata che nell’omeostasi dell’ospite. Identificati come recettori che “triggerano” l’attivazione cellulare, appare oggi chiaro un ruolo modulatorio nella attivazione e differenziazione delle cellule mieloidi. Il TREM-1 funziona da amplificatore della risposta infiammatoria: principalmente espresso da neutrofili e monociti/macrofagi, la sua espressione è upregolata da stimoli microbici. L’ingaggio del TREM-1 con anticorpi attivatori di per se non ha effetti sulla cellula mentre sinergizza con l’attivazione cellulare indotta da “Pattern Recognition Receptors” (PRR)s, quali i Toll-like Receptors e i recettori della famiglia dei NOD. Tale sinergia si esplica in termini di una generale attivazione delle funzioni cellulari, quali la produzione di citochine e chemochine proinfiammatorie e l’attivazione della fagocitosi. A livello intracellulare, TREM-1 attiva il pathway canonico mediato dal motivo ITAM (Immunoreceptor tyrosine based activation motif) contenuto nel dominio citoplasmatico di DAP12. In vivo è stato dimostrato che una forma solubile di TREM-1, agendo da “decoy receptor” ha un ruolo protettivo in modelli animali di infiammazione acuta, quali modelli di endotossemia e di peritonite polimicrobica. Per il TREM-2 sono invece state descritte funzioni diverse, associate anche ad una diversa espressione nei macrofagi, in cellule dendritiche, in osteoclasti e in cellule di microglia. In tali cellule il TREM-2 inibisce la produzione di citochine proinfiammatorie e ne potenzia la fagocitosi, mediando una attivazione alternativa di DAP12 che conduce a effetti anti infiammatori. TREM-2 riveste un ruolo fondamentale nel processo di differenziamento degli osteoclasti sia in vitro che in vivo. Ad oggi non sono stati identificati ligandi per alcun membro della famiglia dei TREM. Con l’utilizzo di una forma solubile del recettore abbiamo identificato alla superficie di neutrofili murini attivati un potenziale ligando di TREM-1. Dopo aver clonato diversi geni selettivamente espressi da questa popolazione cellulare rispetto ad una popolazione di neutrofili negativa per la presenza del ligando, abbiamo constatato che nessuno dei prodotti proteici codificati da questi geni interagisce con TREM-1, lasciando ancora aperta la questione della natura di questo potenziale ligando. Dopo aver invece identificato un potenziale ligando per il TREM-2 espresso alla superficie di diverse linee tumorali, con una approccio biochimico abbiamo isolato da queste cellule un interattore di TREM-2, galectin-1, una lectina specifica per residui di β-lattosio. Abbiamo confermato l’interazione con studi di immunoprecipitazione e di in vitro “binding assay” con Gal-1 immobilizzata su piastra. Inoltre abbiamo dimostrato la specificità dell’interazione tra TREM-2 e Gal- 1 dal momento che i) anticorpi anti Gal-1 e ii) una proteina ricombinante Gal-1 inibiscono il l’interazione di una forma solubile di TREM-2 (TREM-2/Ig) alle cellule tumorali e iii) Gal-1 non interagisce con altri membri della famiglia dei TREM come dimostrato nel saggio in vitro. Nonostante Gal-1 sia una lectina, abbiamo osservato che l’interazione con TREM-2 è mediata da riconoscimenti proteina-proteina. A validare una ruolo funzionale dell’interazione, abbiamo dimostrato che in un modello di osteoclastogenesi in vitro, Gal-1 incrementa notevolmente la formazione di cellule multinucleate positive alla colorazione al TRAP, incrementando inoltre il rapporto nuclei/cellula. Monociti da pazienti affetti dalla sindrome di Nasu-Hakola, difettivi nell’espressione di TREM-2, non sono in grado di differenziare in vitro in osteoclasti maturi e questo difetto di differenziamento non è recuperato dal trattamento con Gal- 1. Questo evidenzia un ruolo della galectin-1, un nuovo interattore di TREM-2, nel processo dell’osteoclastogenesi dipendente da TREM-2.

TREM (triggering receptor expressed on myeloid cell) proteins are a family of cell receptors expressed on myeloid cells that include both activating and inhibiting receptors, based on their ability to interact with the adaptor protein DAP12 or on the presence of a cytoplasmic domain containing ITIM motifs. TREMs are expressed on cells of myeloid origin that function both in the immune system and in remodelling host tissue: these receptors are expressed on granulocytes, monocytes, macrophages, microglia, dendritic cells, osteoclasts, and platelets. Identified as receptors that ‘trigger’ cellular activation, it is now clear that they are modulators of the cellular response, having both positive and negative functions in regulating the activation and differentiation of myeloid cells. They have been proposed to fall into the group of receptors that set signaling “threshold” for cells. TREM-1 functions as an amplifier of inflammation: it is mainly expressed in neutrophils and monocytes/macrophages, in which microbial stimuli strongly upregulate its expression. TREM-1 triggering with activating antibodies does not results in activation by itself, but synergizes with cellular activation induced by Pattern Recognition Receptor, such as TLRs and NOD receptors, in terms of production of inflammatory cytokines and chemokines and induction of phagocytosis and cellular effector function. Intracellularly, TREM-1 engagement activates the canonical activation cascade of protein kinases described for the ITAM containing adaptor DAP12. In vivo, the soluble form of the receptor, potentially acting as a decoy, has inhibiting functions in acute inflammation models, such as endotoxemia and Cecal Ligation and Puncture (CLP). Multiple functions have been described for TREM-2. TREM-2 is expressed broadly by mononuclear phagocytes, including macrophages, microglia and osteoclast precursors. In these cells TREM-2 inhibits TLR-induced cytokine production and potentiates phagocytosis and mediates an alternative activation of DAP12 signaling that leads to anti-inflammatory effects. TREM-2 is fundamental for proper osteoclast differentiation both in vitro and in vivo. So far, no ligand has been identified for any of the members of the family. Using a soluble form of TREM receptors we identified activated neutrophils as TREM-1 ligand expressing cells. We cloned several genes that were selectively expressed by TREM-1L+ neutrophils, but none of the proteins encoded by those genes interacts with TREM-1, leaving an open question on the nature of TREM-1L. Conversely, upon the identification of a candidate ligand for TREM-2 expressed at cell surface of several tumor cell lines, we have isolated a TREM-2 binding protein, galectin-1, a β-lactose lectin, using a biochemical approach. The interaction was confirmed by immunoprecipitation studies and in vitro assay with immobilized Gal-1. TREM-2 binding with GAL-1 is specific since: i) anti Gal-1 antibodies and ii) a recombinant Gal-1 inhibit binding of a soluble form of TREM-2 (TREM-2/Ig) to ligand positive cells; iii) Gal-1 does not interact with other TREM family members as demonstrated by the in vitro binding assay. We also found that Gal-1 interacts with TREM-2 in a protein-protein manner, not involving its carbohydrate recognition domain. In order to validate a functional role of this interaction, we demonstrated that in an in vitro osteoclastogenesis model recombinant Gal-1 enhanced TRAP+ multinucleated cell formation and increases nuclei/cells ratio. Monocytes from TREM-2 deficient patients are unable to differentiate in vitro into mature osteoclasts and addition of the Gal-1 did not rescue the differentiation. This shows the role of the newly identified TREM-2 ligand, galectin-1, in the process of TREM-2-dependent osteoclastogenesis.