Scopo di questo lavoro di dottorato è lo studio dello stress ossidativo e delle modifiche metaboliche indotte dall’elicitazione con estratto di lievito in colture in sospensione di Passiflora garckei. Al fine di osservare gli eventi precoci coinvolti nel processo di elicitazione, si sono dapprima misurati il grado di alcalinizzazione del mezzo di coltura e la produzione di ROS e NO. In secondo luogo, si è cercata una possibile correlazione tra questi eventi e le modifiche del metaboloma, somministrando differenti combinazioni di donatori di ROS e NO. Per effettuare uno studio così complesso in una specie non modello, alla quale non è possibile applicare i più comunemente utilizzati strumenti genetico-molecolari, si è applicato un approccio di tipo metabolomico. Questo tipo di approccio integra differenti metodiche di analisi, dall’NMR all’HPLC-DA, all’HPCL-MS e alla microspettroscopia FT-IR, al fine di effettuare un’analisi qualitativa e quantitativa del maggior numero possibile di metaboliti. L’elicitazione di cellule in sospensione di P. garckei con estratto di lievito ha portato ad un precoce accumulo di alcuni metaboliti secondari, il cui massimo accumulo è 24 ore dall’inizio del trattamento. Preliminari analisi di NMR, combinate con un metodo preparativo basato sull’SPE-C18, hanno permesso di separare gli zuccheri dai composti aromatici, evidenziando come i controlli siano nettamente differenti dalle cellule trattate con estratto di lievito soprattutto per quanto riguarda la regione fenolica. Iniziando dai dati di NMR, per studiare il metaboloma di P. garckei estraibile in metanolo, sono state applicate l’analisi HPLC-DA e la più sensibile HPLCMS. Le analisi di statistica multivariata (PCA) hanno dimostrato ancora una volta come controlli e trattati sono ben separati in due gruppi: i trattati presentano un contenuto di zuccheri minore rispetto al controllo e un maggiore contenuto di acidi idrossicinnamici, flavonoidi e glucosidi cianogenici. La maggior parte delle variazioni indotte dall’elicitazione in P. garckei sembra essere correlate all’attuazione di strategie di difesa attiva e passiva nei confronti dell’attacco da parte di uno stress biotico. Troviamo, infatti, flavonoidi e glucosidi cianogenici come difese attive da patogeni e acidi idrossicinnamici e cellulosa come difese passive, ovvero come rinforzamento della prima barriera difensiva che è la parete cellulare. Accanto alle analisi NMR e HPLC-MS degli estratti metanolici, sono state eseguite anche analisi di microspettroscopia FTIR su cellule disidratate. Da queste analisi è emerso un cambiamento nell’organizzazione dell’intera parete cellulare, con modifiche verso una struttura più rigida e meno plastica, a segnalare il già evidente (con NMR e HPLC-MS) rinforzamento della prima barriera difensiva che è la parete. Queste analisi sono state confermate anche da analisi di microscopia ottica che ha mostrato un aumento della cellulosa. Infine, la produzione di ROS e NO è risultata essere una diretta conseguenza del trattamento con estratto di lievito. A questo proposito si nota anche come la produzione di ROS influenza l’accumulo di NO e viceversa e, inoltre, le cinetiche di produzione ROS e NO sono correlate in modo diretto con il profilo metabolico delle cellule di P. garckei. In dettaglio, dopo il trattamento con estratto di lievito, l’accumulo di NO e ROS segue una cinetica di tipo bifasico con un primo massimo a 30 minuti dal trattamento e un secondo picco dopo 8 ore, in linea con quanto già emerso per altre linee cellulari. La novità di questo lavoro sta nello studio di come differenti combinazioni di NO e ROS siano coinvolte nell’accumulo di metaboliti secondari indotto da estratto di lievito. ROS e NO sono stati infatti misurati in assenza di elicitazione, dopo aver trattato le cellule con diverse combinazioni di donatori degli stessi (DCFH-DA per ROS e SNP per NO). Risultato dei diversi trattamenti sono stati una serie di differenti cinetiche di accumulo di ROS e NO parimenti a diversi profili metabolici. In particolare, alcune combinazioni inducevano un effetto simile a quello ottenuto con l’elicitazione con lievito, confermando come ROS e NO siano intercorrelati, ma anche suggerendo che essi siano necessari e sufficienti per indurre una risposta di difesa, come è l’accumulo di metaboliti. Prospettive future per questo lavoro potrebbero essere ulteriori analisi di altre frazioni di P. garckei, l’identificazione di quei metaboliti ancora non identificati e lo studio di altri eventi correlati all’elicitazione come i flussi ionici.

The aim of this thesis was to study the oxidative burst and metabolome modifications induced by elicitation with yeast extract in suspension cultures of Passiflora garckei. In order to observe early events induced by elicitation we first measured pH medium alkalinization and ROS and NO production. Secondly, we looked for a possible correlation between these events and metabolome changes, by administrating different combinations of ROS and NO donors. To perform such a complex study in a non model species, lacking genetic tools, we used a metabolomic approach, which can integrate different techniques, from NMR to HPLC-DA, LC-MS and FTIR microspectroscopy to obtain a qualitative and quantitative analysis on as many metabolites as possible. The treatment of P. garckei suspension cells with yeast extract caused an accumulation of certain secondary metabolites that starts early and reaches its maximum 24 hours after the treatment. Preliminary NMR analysis combined to SPEC18 preparation method allowed us to separate sugars from aromatic compounds thus revealing that controls differ from treated samples mainly in the phenolics region. Starting from NMR data, we applied the HPLC-DA and then the more sensitive HPLCMS in order to analyse the methanol extractable sub-metabolome of P. garckei cells. PCA analysis showed that treated samples and controls were still well separated into two groups and they differed because of a lower amount of free sugars and a higher amount of hydroxycinnamic acids, flavonoids and cyanogenic glucosides in treated samples. Most of metabolic changes induced in P. garckei elicitated cells are related to direct defence strategies e.g. flavonoids and cyanogenic glycosides and to passive defence, such as structural reinforcement of the cell wall with an increase in hydroxycynnamic acids. Besides HPLC-MS and NMR analysis of methanolic extracts, also in situ FTIR microspectroscopy analysis of dehydrated cells showed differences between control and treated samples. FTIR microspectroscopy allowed underlining cellulose changes after elicitation, not detectable with metabolomic approach on methanolic extracts. FTIR data were in line with the increase in Calcofluor fluorescence. The increase in cellulose reinforces “passive defence”, being cell wall the first barrier to environmental attacks. ROS and NO production resulted to be a direct consequence of yeast extract elicitation; moreover, ROS production influences NO accumulation and vice-versa, and the kinetics of ROS and NO production is directly related to different metabolic profiles. In detail, after YE administration, NO and ROS production followed a biphasic kinetics of accumulation, with a first maximum after 30 minutes and a second after 8 hours. This has already been reported for other cell lines. The novelty in the present work was to study whether combination of NO and ROS accumulation were involved in yeast-extract secondary metabolite accumulation. ROS and NO were then measured in absence of elicitation, after NO and ROS donors administration. The results showed that different combinations of donors cause both different kinetics of NO and ROS accumulation and different metabolic profiles. In particular, some of the combinations induced an effect very similar to that induced by yeast extract treatment, confirming that ROS and NO productions are interrelated, but also suggesting that they are necessary and sufficient to induce some defence responses, as metabolite accumulation Future perspectives on this topic could be the analysis of other fractions of P. garckei extracts, the identification of still “unidentified” metabolites and investigation of other events induced by elicitation, such as ion fluxes.

Oxidative burst and metabolome modifications inducted by elicitation with yeast extract in suspension cultures of Passiflora garckei

FRACCAROLI, Marica
2008-01-01

Abstract

The aim of this thesis was to study the oxidative burst and metabolome modifications induced by elicitation with yeast extract in suspension cultures of Passiflora garckei. In order to observe early events induced by elicitation we first measured pH medium alkalinization and ROS and NO production. Secondly, we looked for a possible correlation between these events and metabolome changes, by administrating different combinations of ROS and NO donors. To perform such a complex study in a non model species, lacking genetic tools, we used a metabolomic approach, which can integrate different techniques, from NMR to HPLC-DA, LC-MS and FTIR microspectroscopy to obtain a qualitative and quantitative analysis on as many metabolites as possible. The treatment of P. garckei suspension cells with yeast extract caused an accumulation of certain secondary metabolites that starts early and reaches its maximum 24 hours after the treatment. Preliminary NMR analysis combined to SPEC18 preparation method allowed us to separate sugars from aromatic compounds thus revealing that controls differ from treated samples mainly in the phenolics region. Starting from NMR data, we applied the HPLC-DA and then the more sensitive HPLCMS in order to analyse the methanol extractable sub-metabolome of P. garckei cells. PCA analysis showed that treated samples and controls were still well separated into two groups and they differed because of a lower amount of free sugars and a higher amount of hydroxycinnamic acids, flavonoids and cyanogenic glucosides in treated samples. Most of metabolic changes induced in P. garckei elicitated cells are related to direct defence strategies e.g. flavonoids and cyanogenic glycosides and to passive defence, such as structural reinforcement of the cell wall with an increase in hydroxycynnamic acids. Besides HPLC-MS and NMR analysis of methanolic extracts, also in situ FTIR microspectroscopy analysis of dehydrated cells showed differences between control and treated samples. FTIR microspectroscopy allowed underlining cellulose changes after elicitation, not detectable with metabolomic approach on methanolic extracts. FTIR data were in line with the increase in Calcofluor fluorescence. The increase in cellulose reinforces “passive defence”, being cell wall the first barrier to environmental attacks. ROS and NO production resulted to be a direct consequence of yeast extract elicitation; moreover, ROS production influences NO accumulation and vice-versa, and the kinetics of ROS and NO production is directly related to different metabolic profiles. In detail, after YE administration, NO and ROS production followed a biphasic kinetics of accumulation, with a first maximum after 30 minutes and a second after 8 hours. This has already been reported for other cell lines. The novelty in the present work was to study whether combination of NO and ROS accumulation were involved in yeast-extract secondary metabolite accumulation. ROS and NO were then measured in absence of elicitation, after NO and ROS donors administration. The results showed that different combinations of donors cause both different kinetics of NO and ROS accumulation and different metabolic profiles. In particular, some of the combinations induced an effect very similar to that induced by yeast extract treatment, confirming that ROS and NO productions are interrelated, but also suggesting that they are necessary and sufficient to induce some defence responses, as metabolite accumulation Future perspectives on this topic could be the analysis of other fractions of P. garckei extracts, the identification of still “unidentified” metabolites and investigation of other events induced by elicitation, such as ion fluxes.
2008
metabolome modifications; elicitation; passiflora garckei
Scopo di questo lavoro di dottorato è lo studio dello stress ossidativo e delle modifiche metaboliche indotte dall’elicitazione con estratto di lievito in colture in sospensione di Passiflora garckei. Al fine di osservare gli eventi precoci coinvolti nel processo di elicitazione, si sono dapprima misurati il grado di alcalinizzazione del mezzo di coltura e la produzione di ROS e NO. In secondo luogo, si è cercata una possibile correlazione tra questi eventi e le modifiche del metaboloma, somministrando differenti combinazioni di donatori di ROS e NO. Per effettuare uno studio così complesso in una specie non modello, alla quale non è possibile applicare i più comunemente utilizzati strumenti genetico-molecolari, si è applicato un approccio di tipo metabolomico. Questo tipo di approccio integra differenti metodiche di analisi, dall’NMR all’HPLC-DA, all’HPCL-MS e alla microspettroscopia FT-IR, al fine di effettuare un’analisi qualitativa e quantitativa del maggior numero possibile di metaboliti. L’elicitazione di cellule in sospensione di P. garckei con estratto di lievito ha portato ad un precoce accumulo di alcuni metaboliti secondari, il cui massimo accumulo è 24 ore dall’inizio del trattamento. Preliminari analisi di NMR, combinate con un metodo preparativo basato sull’SPE-C18, hanno permesso di separare gli zuccheri dai composti aromatici, evidenziando come i controlli siano nettamente differenti dalle cellule trattate con estratto di lievito soprattutto per quanto riguarda la regione fenolica. Iniziando dai dati di NMR, per studiare il metaboloma di P. garckei estraibile in metanolo, sono state applicate l’analisi HPLC-DA e la più sensibile HPLCMS. Le analisi di statistica multivariata (PCA) hanno dimostrato ancora una volta come controlli e trattati sono ben separati in due gruppi: i trattati presentano un contenuto di zuccheri minore rispetto al controllo e un maggiore contenuto di acidi idrossicinnamici, flavonoidi e glucosidi cianogenici. La maggior parte delle variazioni indotte dall’elicitazione in P. garckei sembra essere correlate all’attuazione di strategie di difesa attiva e passiva nei confronti dell’attacco da parte di uno stress biotico. Troviamo, infatti, flavonoidi e glucosidi cianogenici come difese attive da patogeni e acidi idrossicinnamici e cellulosa come difese passive, ovvero come rinforzamento della prima barriera difensiva che è la parete cellulare. Accanto alle analisi NMR e HPLC-MS degli estratti metanolici, sono state eseguite anche analisi di microspettroscopia FTIR su cellule disidratate. Da queste analisi è emerso un cambiamento nell’organizzazione dell’intera parete cellulare, con modifiche verso una struttura più rigida e meno plastica, a segnalare il già evidente (con NMR e HPLC-MS) rinforzamento della prima barriera difensiva che è la parete. Queste analisi sono state confermate anche da analisi di microscopia ottica che ha mostrato un aumento della cellulosa. Infine, la produzione di ROS e NO è risultata essere una diretta conseguenza del trattamento con estratto di lievito. A questo proposito si nota anche come la produzione di ROS influenza l’accumulo di NO e viceversa e, inoltre, le cinetiche di produzione ROS e NO sono correlate in modo diretto con il profilo metabolico delle cellule di P. garckei. In dettaglio, dopo il trattamento con estratto di lievito, l’accumulo di NO e ROS segue una cinetica di tipo bifasico con un primo massimo a 30 minuti dal trattamento e un secondo picco dopo 8 ore, in linea con quanto già emerso per altre linee cellulari. La novità di questo lavoro sta nello studio di come differenti combinazioni di NO e ROS siano coinvolte nell’accumulo di metaboliti secondari indotto da estratto di lievito. ROS e NO sono stati infatti misurati in assenza di elicitazione, dopo aver trattato le cellule con diverse combinazioni di donatori degli stessi (DCFH-DA per ROS e SNP per NO). Risultato dei diversi trattamenti sono stati una serie di differenti cinetiche di accumulo di ROS e NO parimenti a diversi profili metabolici. In particolare, alcune combinazioni inducevano un effetto simile a quello ottenuto con l’elicitazione con lievito, confermando come ROS e NO siano intercorrelati, ma anche suggerendo che essi siano necessari e sufficienti per indurre una risposta di difesa, come è l’accumulo di metaboliti. Prospettive future per questo lavoro potrebbero essere ulteriori analisi di altre frazioni di P. garckei, l’identificazione di quei metaboliti ancora non identificati e lo studio di altri eventi correlati all’elicitazione come i flussi ionici.
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Tipologia: Tesi di dottorato
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