Caratterizzazione strutturale e funzionale di AHb1 ed AHb2, emoglobine non simbiontiche da Arabidopsis thaliana

Le globine costituiscono una famiglia evolutiva di grandi dimensioni. Il numero di famiglie globiniche note è cresciuto progressivamente a partire dagli anni ’70, quando esso si limitava principalmente alla mioglobina (Mb) e all’emoglobina (Hb) dei vertebrati, e alle leg-emoglobine (legHbs) o emoglobine simbiontiche (sHbs), delle piante leguminose. La recente scoperta di nuovi membri in diverse ed antiche forme di vita, ha permesso di ampliare ulteriormente gli orizzonti evolutivi del mondo globinico ed ha inoltre rinvigorito le ricerche delle funzioni globiniche oltre al classico immagazzinamento e trasporto di ossigeno. In particolare, la scoperta nel mondo vegetale delle cosiddette emoglobine non simbiontiche (nsHbs), presenti anche in piante non leguminose, ha permesso di trovare un chiaro razionale filogenetico per le emoglobine simbiontiche (sHbs), la cui origine evolutiva era rimasta fino ad allora estremamente difficile da spiegare. Sia le sHbs, che le nsHbs, infatti, si sarebbero evolute a partire da un’emoglobina vegetale primordiale, che avrebbe poi originato per duplicazione genica e successiva divergenza delle sequenze, due classi filogenetiche, denominate classe 1 e classe 2. Si ritiene che nelle leguminose, dove si ritrovano i principali esempi di emoglobine di trasporto dell’ossigeno nelle piante, le emoglobine di classe 2 sarebbero andate incontro ad una specializzazione funzionale notevole, evolvendosi interamente nelle cosiddette leg-emoglobine (legHbs), proteine coinvolte nella simbiosi tra queste piante ed i batteri azotofissatori, e denominate pertanto anche emoglobine simbiontiche (sHbs). La specializzazione funzionale delle legHbs (o sHbs) avrebbe trovato i suoi determinanti molecolari non solo nella divergenza della struttura primaria rispetto agli altri membri di classe 2, ma anche, e soprattutto, in una differente organizzazione strutturale del ferro eminico: infatti, mentre le altre emoglobine vegetali, in assenza di ligandi esogeni, presentano esacoordinazione del ferro, le legHbs presentano pentacoordinazione del ferro, lasciando libero il sesto sito di coordinazione. Mentre le legHbs, essendo note da tempo, sono state ben caratterizzate, le Hb esacoordinate, essendo state scoperte più recentemente, non sono state ancora associate ad una funzione fisiologica univoca nelle piante; quello che si può escludere con certezza, sulla base della loro ubiquitarieta’ nel mondo vegetale, è che queste emoglobine siano in qualche modo coinvolte nel processo simbiontico, e pertanto, esse vengono anche denominate genericamente Hbs non simbiontiche (nsHbs). Come per le sHbs, che vengono sovraespresse specificamente a livello del nodulo radicale, anche per le nsHbs vi è tessuto-specificità dell’espressione, ma questa specificità è classe-dipendente, ossia varia a seconda della classe considerata: infatti, i prodotti genici di classe 1 vengono sovraespressi in condizioni di ipossia o in presenza di NO3 -, a livello delle radici o delle foglie delle rosette; i geni di classe 2, invece, vengono indotti in condizioni di ipotermia in tutta la pianta. L’ubiquitarietà delle nsHbs nel mondo vegetale, da un lato, e la tessuto-specificità dell’espressione, dall’altro, sottolineano la grande importanza funzionale di queste proteine e la presenza di ruoli diversi tra i membri di questa famiglia. Denominatore comune, tuttavia, della funzionalità delle nsHbs è senza dubbio, il possesso di un’elevatissima affinità per l’ossigeno, di molto superiore a quella della controparte simbiontica, e riconducibile principalmente ad una ridotta costante cinetica di dissociazione dell’ossigeno (koff). I residui stabilizzatori della tasca distale dell’eme giocano un ruolo chiave nel determinare la ridotta koff del ligando, stabilendo un legame idrogeno con il ligando stesso e, pertanto, rallentandone la cinetica di dissociazione. La necessità per una stabilizzazione chimica dell’ossigeno sarà tanto maggiore, quanto maggiore sarà la parziale carica negativa sull’ossigeno, o, in altre parole, quanto più l’ossigeno sarà attivato. Evidenze riguardanti funzioni enzimatiche antiche basate sull’attivazione dell’ossigeno stanno diventando progressivamente più numerose; una di queste, è rappresentata dalla conversione enzimatica diossigenasica, definita funzione NOD, dell’·NO a nitrato, rilevata nelle flavoemoglobine batteriche e successivamente confermata ed estesa anche alla Hb e Mb. In tutti i casi finora esaminati, la funzione NOD ed il meccanismo catalitico associato sembrano dipendere pesantemente dal grado di attivazione dell’ossigeno. Nel complesso, quindi, le due prerogative imprescindibili per la funzionalità di una nsHb sono l’esacoordinazione e l’alta affinità per l’ossigeno. Lo studio in vitro delle implicazioni strutturali e funzionali di queste due proprietà può restituire importanti informazioni circa il ruolo di queste proteine in vivo, ed eventualmente confermare o smentire il loro possibile coinvolgimento in attività enzimatiche di tipo NOD. Con questo obiettivo, ci si è pertanto rivolti ad uno studio di struttura e funzione per due nsHb da Arabidopsis thaliana, denominate AHb1 ed AHb2. Mediante tecniche spettroscopiche di assorbimento UV-Vis e di Raman risonante è stato possibile dimostrare che, in assenza di ligando, il grado di esacoordinazione varia tra le due proteine e che, mentre AHb1 è presente come miscela di due forme, una esacoordinata, e l’altra pentacoordinata, AHb2, nelle stesse condizioni, è completamente esacoordinata. Inoltre, l’analisi spettroscopica in dicroismo circolare della regione Soret per le due proteine ha evidenziato significative differenze tra le due isoforme anche a livello dell’organizzazione strutturale della tasca di legame dell’eme, sottolineando, d’altra parte, la vicinanza filogenetica di AHb2 alle legHbs. L’analisi del comportamento autoossidativo di AHb1 in funzione del pH ha evidenzato cinetiche più rapide rispetto a quelle delle proteine di trasporto, suggerendo per questa isoforma un grado di specializzazione funzionale che va verso l’attivazione, più che verso la stabilizzazione dell’ossigeno. Le evidenze risultanti dall’autoossidazione, in particolare relativamente all’attivazione del ligando ed al grado di polarizzazione del legame ferro-ligando, hanno trovato conferma nello studio Raman dei complessi di AHb1 con CO...

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