Polimeri "imprinted" per l'analisi proteomica - Molecularly imprinted Polymers for proteome analysis

Il lavoro di ricerca nell’ambito del Corso in Dottorato in Biotecnologie Industriali e Ambientali è stato svolto nel dipartimento Scientifico Tecnologico dell’Università di Verona, nei Laboratori di Metodologie Biochimiche. Il lavoro è stato svolto in cotutela con l’università di Cranfield, UK e supervisionato dalla Dr.ssa Alessandra Bossi e dal Prof. Sergey Piletsky. Il lavoro si è svolto nell’ambito della proteomica, nel tentativo di risolvere uno dei principali problemi che affligge lo studio del proteoma d’organismi complessi. Come è ben noto in fluidi biologici o campioni complessi sono presenti diversi intervalli di espressione di proteine. Alcune (geni strutturali o house-keeping) sono presenti nell’ordine dei mg/ml mentre altre sono espresse nell’ordine dei ug/ml o pg/ml). Spesso quindi la presenza di proteine molto espresse maschera il segnale di proteine meno abbondanti, queste ultime generalmente considerate potenziali biomarcatori per diverse malattie. La rivelazione di questi potenziali biomarcatori risulta difficile e con esso la diagnosi della patologia. La letteratura riporta differenti approcci che permettono la rimozione di proteine molto abbondanti; essi si basano su approcci di tipo cromatografico, elettroforetico o metodologie coadiuvate da anticorpi. In questo progetto di tesi, si è voluto creare e applicare una tecnologia innovativa all’analisi del proteoma, mai applicata fino ad ora: la creazione di polimeri selettivi per una specifica proteina. In particolare, sono stati creati polimeri specifici per una delle proteine più problematiche nell’analisi del siero umano vale a dire l’albumina, che rappresenta circa il 60% delle proteine totali espresse. Tali polimeri sono creati con una particolare tecnologia, in altre parole durante la fase di polimerizzazione, la proteina che deve essere rivelata nel campione è aggiunta alla miscela di polimerizzazione, in modo da creare, durante la fase di polimerizzazione una specifica cavità nella matrice polimerica, come un vero e proprio stampo. Le proprietà di tali polimeri chiamati “MIP” vengono confrontate con le proprietà dello stesso polimero in cui durante la fase di polimerizzazione non è stato usata nessuna proteina (il controllo). In seguito alla polimerizzazione la proteina utilizzata è rimossa lasciando libera una cavità che è in grado di ospitare la stessa proteina una volta che essa verrà messa in contatto con il polimero stesso. La tesi che si fonda su questa tecnologia si può quindi dividere in due sezioni: Sezione I: Sviluppo di una tecnologia per derivatizzare palline di silice con acido 3-amminofenilboronico e in grado di riconoscere l’albumina di siero umano. Sezione II: Creazione di nuovi polimeri costituiti da poliacrilammide (PAA) e capaci di rimuovere l’albumina di siero umano.

The research work carried out in the last three years and presented in this thesis, has been conduced in the Laboratory of Biochemical Methodologies of the Scientific and Technologic Department of the University of Verona, in collaboration with Cranfield Health of the University of Cranfield (UK). One of the main problems in proteome analysis is the presence of high abundance proteins from house-keeping or structural genes, that mask the signal of low abundance ones. The low ones are often potential biomarkers to study specific diseases. In literature different approaches for the removal of high abundance proteins are described, among which electrophoretic and chromatographic pre-fractionation techniques and antibodymediated depletion of specific proteins from biological fluids (i.e., human serum, cerebrospinal fluid). The aim of my PhD thesis has been using Molecularly Imprinted Polymers (MIPs) to manufacture a polymeric synthetic receptor capable of recognising Human Serum Albumin from human serum (60% of the total serum proteins). Molecular imprinting can be defined as the process of template-induced formation of specific recognition sites (binding or catalytic) in a material, where the template drives the positioning and orientation of the material’s structural components by a self-assembling mechanism. The polymer are very easy to prepare and to use, finally cheaper than some methods usually applied. Such a MIP would then be used to remove albumin from serum samples, in order to improve and to help the analysis of the “hidden” proteome. The objectives of my PhD project can be grouped in two different sections, according to which the present thesis is structured: Section I: Development of a new methodology for imprinting silica beads for the recognition of Human Serum Albumin. Section II: Creation of new imprinted polymers made of polyacrylamide gel capable of removing Human Serum Albumin from human serum, thus increasing the signal of low abundance proteins in two-dimensional maps.