Proteomic analysis of autoantibody reactivity to central nervous system antigens in sera and cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients

La Sclerosi multipla (SM) appartiene ad un folto gruppo di malattie infiammatorie demielinizzanti del sistema nervoso centrale (CNS), in cui la risposta autoimmune è orientata verso la mielina e le cellule produttrici di mielina, gli oligodendrociti, che infine porta a demielinizzazione e perdita oligodendrocitaria. L'eterogeneità nelle alterazioni morfologiche del cervello è rilevabile con risonanza magnetica (MRI), valutazione istopatologica e nella presentazione clinica. Tre sono le principali forme di SM. Non è chiaro quali fattori sono responsabili dei diversi decorsi. La forma Recidivante-remittente (RR)-SM la più frequente (85% -90% dei pazienti), caratterizzata da attacchi imprevedibili (recidive), seguiti da periodi di mesi o anni di relativa tranquillità (sgravio), senza nuovi segni di malattia. La maggior parte dei pazienti con SM-RR può successivamente sviluppare una forma secondaria progressiva (SP)-SM in cui si iniziano ad avere cali neurologici e attacchi acuti senza alcun periodo di remissione. Circa il 10% - 15% dei pazienti si presenta con malattia ad esordio insidioso e costante progressione, questa forma è chiamata primaria progressiva (PP)-MS. E' stato dimostrato che la reazione autoimmune coinvolge sia l'attivazione dei linfociti T che B. L'attivazione di cellule T CD4 + autoreattive e la loro differenziazione in un fenotipo Thl sono eventi cruciali nelle prime fasi, e probabilmente sono importanti anche nel lungo periodo di evoluzione della malattia. I1 danno del tessuto bersaglio, il sistema nervoso centrale, è, tuttavia, molto probabilmente mediato da altre componenti del sistema immunitario, come ad esempio gli anticorpi (IGS), fattori del complemento, cellule T CD8 +, e fattori prodotti cellule dell' immunità innata . L'osservazione che gli IGS presentano valori elevati nel liquido cerebrospinale (CSF) di pazienti con SM è stato di rilevante importanza suggerendo un ruolo delle cellule B e degli anticorpi nella patologia della SM. Nella maggior parte degli studi la ricerca si è concentrata su proteine della mielina e altri complonenti del CNS proteine. Nonostante alcuni studi sottolineano l'importanza di anticorpi specifici della mielina, altri non riescono a confermare questi dati. Abbiamo tentato di superare tali restrittivi approcci utilizzando un ampio pannello di antigeni derivati da estratti del tessuto bersaglio. Nel presente studio, abbiamo confrontato, attraverso elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilamide (2D-PAGE) e immunoblotting, le IgG provenienti dal siero e dal liquido cerebrospinale di pazienti con SM con antigeni di controllo derivati da materia bianca normale del CNS. Gli spot reattivi sono stati quindi individuati tramite spettrometria di massa (MAS) e 1 o immunoblotting. Questo approccio di tipo immunomico ha consentito l'identificazione di un ristretto numero di isoforrne di proteine neuronali riconosciute in maniera specifica dai sieri SM e dai CSF, in gran parte localizzate su oligodendrociti e 1 o citoscheletro. Quasi tutti i pazienti con SM presentano, nel CSF, IgG dirette verso isoforme di proteine da oligodendrociti e10 da citoscheletro. Quasi tutti i pazienti presentano IgG del CSF dirette contro un'isoforma di una delle principali proteine degli oligodendrociti, la molecola Transketolase (TK), contro la proteina cyclic nucleotide phosphodiesterase type I (CNPase I), la collapsin response mediator protein 2 e contro tubulin p4. E' Interessante notare che nei pazienti SM, il 50% delle IgG da CSF riconosce la TK, che è stata in gran parte localizzata su oligodendrociti dalla materia bianca umana normale e da campioni SM. L'autoreattività delle IgG verso proteine del citoscheletro (radixina, sirtuina 2 e proteine che interagiscono con l'actina l) è diffusa maggiormente in pazienti con SM secondaria progressiva. Tra le proteine riconosciute dalle IgG del siero, quasi tutti i pazienti con SM riconoscono in maniera specifica un numero limitato di proteine dei neuronildel citoscheletro, mentre la CNPase è l'antigene più frequentemente riconosciuto (44%) dalle IgG sieriche di pazienti SM. I1 nostro approccio immunomico ha gettato nuova luce sul repertorio autoimmune rivelando nuovi possibili autontigeni oigodendrogliali e10 neuronali, che possono avere potenziali e importanti implicazioni patogeniche e servire inoltre come biomarcatori di malattia in diagnostica.

Multiple Sclerosis (MS) belongs to a large group of inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system (CNS), in which the autoimmune response is directed to myelin and myelin-producing cells, the oligodendrocytes, and eventually leads to demyelination and oligodendrocyte loss. Heterogeneity in morphological alterations of the brain is detectable by magnetic resonance imaging (MRI), histopathological evaluation, as well as in clinica1 presentation. Three are the major forms of MS. It is not clear which factors are responsible for the different courses. Relapsing-remitting (M)-MS is the most frequent form (85%-90% of patients) characterized by unpredictable attacks (relapses) followed by periods of months to years of relative quiet (remission) with no new signs of disease activity. Most RR-MS patients later develop secondary progressive (SP)-MS, in which they begin to have neurologic decline between their acute attacks without any definite periods of remission. About 10%-15% of patients present with insidious disease onset and steady progression, termed primary progressive (PP)-MS. The autoimmune reaction has been shown to involve the activation of both T and B lymphocytes. The activation of CD4+ autoreactive T cells and their differentiation into a Thl phenotype are crucial events in the initial steps, and these cells are probably also important players in the long-term evolution of the disease. Damage of the target tissue, the central nervous system, is, however, most likely mediated by other components of the immune system, such as antibodies (Igs), complement, CD8+ T cells, and factors produced by innate immune cells. The observation that Igs are elevated in the cerebrospinal fluid (CSF) of MS patients has been the most important and earliest evidence suggesting a role for B cells and antibodies in the pathology of MS. In most of the studies the search for autoantigens has focused on myelin proteins and other CNS components. Although some studies emphasize the relevance of myelin-specific antibodies, others fail to confirm these data. We have overcome such restrictive approaches using a large pane1 of antigens derived from target tissue extracts. In the present study, we compared by bidimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and immunoblotting the IgG repertoires from serum and CSF of contro1 and MS patients against antigens derived from CNS normal white matter. The reactive spots were then identified by mass spectrometry (MaS) andlor immunoblotting. This immunomic approach enabled the identification of a restricted number of neural protein isoforms specifically recognized by MS sera and CSF, which were mostly localized on oligodendrocytes andlor cytoskeleton. Almost al1 MS patients had CSF IgG directed to isoforms of one of the oligodendroglial molecules transketolase (TK), cyclic nucleotide phosphodiesterase type I (CNPase I), collapsin response mediator protein 2 and tubulin P4. Interestingly, 50% of MS CSF IgG recognized TK, which was mostly localized on oligodendrocytes in human white matter from normal and MS samples. IgG autoreactivity to cytoskeletal proteins (radixin, sirtuin 2 and actin interacting protein 1) was prevalent in secondary progressive MS patients. Among the proteins recognized by serum IgG, almost al1 MS patients specifically recognized a restricted number of neuronal/cytoskeletal proteins, while CNPase I was the oligodendroglial antigen most frequently recognized (44%) by MS seric IgG. Our immunomic approach shed new light on the autoimmune repertoire present in MS patients revealing nove1 oligodendroglial andlor neuronal putative autoantigens, which may have potential important pathogenic implications and also serve as biomarkers of disease as well as useful diagnostic tools.