Nuove molecole coinvolte nel differenziamento e nel reclutamento delle cellule dendritiche

In questo lavoro di tesi è stato studiato il ruolo di due nuove molecole, l’attivina A e la chemerina, nella biologia delle cellule dendritiche. Le cellule dendritiche (DC) costituiscono una popolazione eterogenea di cellule di origine ematopoietica caratterizzate dalla capacità di catturare, processare e presentare antigeni ai linfociti T naïve. L’interazione delle DC con le cellule T può portare a diverse forme di risposta immunitaria o all’induzione della tolleranza, a seconda del tipo di cellula dendritica e del suo stato di attivazione. Le diverse sottopopolazioni di cellule dendritiche si differenziano per localizzazione, markers di membrana, patterns di migrazione e funzioni immunologiche. Le DC sono classicamente suddivise in due principali gruppi, le cellule dendritiche convenzionali (cDC) e le cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC). Le cellule dendritiche convenzionali sono caratterizzate dal possedere i tipici prolungamenti dendritici anche in assenza di stimoli infiammatori o di infezioni e sono localizzate nei tessuti linfoidi o nei tessuti periferici, in particolare a livello della cute e delle mucose. Tra queste, rivestono un ruolo particolarmente importante le cellule di Langerhans (LC), che sono localizzate a livello dell’epidermide dove svolgono un ruolo di sentinelle, in quanto catturano gli antigeni con cui vengono in contatto e migrano verso i linfonodi dove svolgono il loro ruolo di cellule presentanti l’antigene. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono localizzate nel sangue e negli organi linfoidi secondari, presentano una forma sferica e acquisiscono un tipico aspetto “dendritico” solo in seguito a maturazione. La loro caratteristica fondamentale è la capacità di produrre grandi quantità di IFN di tipo I in risposta a stimoli virali. E’ possibile ottenere DC differenziate in vitro (Mo-DC) coltivando monociti per sei giorni in presenza di GM-CSF e IL-4. Se a queste citochine si aggiunge anche il TGF-β, si ottengono cellule dendritiche con caratteristiche riconducibili alle cellule di Langerhans (presenza dei granuli di Birbeck e della langherina). La prima parte di questo lavoro di tesi ha riguardato lo studio di una molecola appartenente alla famiglia del TGF-β, l’attivina A, nota per avere un ruolo chiave nello sviluppo della cute e nel processo di riparazione delle ferite. In particolare, è stata studiata la produzione dell’attivina A da parte delle DC in vitro e la sua capacità di indurre il differenziamento di monociti in cellule dendritiche. E’ stato innanzitutto dimostrato che le Mo-DC rilasciano elevati livelli di attivina A durante il processo di maturazione indotto da agonisti dei recettori Toll-like (TLR), da batteri, dal TNF e dal ligando del CD40 (CD40L). La produzione dell’attivina A è risultata influenzata negativamente dalla presenza di molecole antiinfiammatorie quali il desametasone o l’IL-10. Per quanto riguarda la capacità dell’attivina A di influenzare il differenziamento di monociti in cellule dendritiche, è stato osservato che questa citochina è in grado di indurre la generazione di cellule di Langerhans a partire da monociti in assenza del TGF-β. Le LC indotte dall’attivina A (ActA-LC) hanno presentato i marker tipici delle cellule di Langerhans (langherina, Ecaderina, CLA, CCR6, granuli di Birbeck) e sono risultate in grado di stimolare la proliferazione dei linfociti T in una reazione leucocitaria mista. Sono stati inoltre effettuati esperimenti su espianti di cute umana e si è visto che l’iniezione intradermica di attivina A provoca un aumento del numero di cellule CD1a+ e langherina+ sia nell’epidermide che nel derma. Infine, in campioni di cute di pazienti affetti da lichen planus, è stata evidenziata un’associazione tra l’accumulo di LC nel derma e un’abbondante produzione di attivina A. Ciò induce a ipotizzare che l’attivina A possa avere un ruolo significativo nel differenziamento delle LC nel lichen planus. In conclusione, questa prima parte dello studio presenta un nuovo modello in cui l’attivina A induce il differenziamento di cellule circolanti CD14+ in cellule di Langerhans. Poiché l’attivina A è prodotta abbondantemente in alcune condizioni infiammatorie, si propone che questa citochina possa rappresentare una nuova molecola, alternativa al TGFβ, responsabile del differenziamento delle cellule di Langerhans in situazioni infiammatorie/autoimmuni. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi è stato studiato il ruolo di un nuovo fattore chemotattico, la chemerina, nel reclutamento delle cellule dendritiche plasmacitoidi nella cute psoriasica. E’ noto infatti che la psoriasi è caratterizzata dalla presenza di pDC a livello della cute, ma le molecole coinvolte nel loro accumulo sono sconosciute. La chemerina è l’unico fattore chemiotattico infiammatorio attivo sulle cellule dendritiche plasmacitoidi in vitro. E’ stato infatti dimostrato che le pDC possiedono recettori della chemerina (ChemR23) funzionali, in quanto sono in grado di rispondere a un gradiente di chemerina migrando attraverso un monostrato di cellule endoteliali in saggi di trasmigrazione. In questo studio è stata analizzata l’espressione della chemerina nella cute di pazienti psoriasici ed è stato osservato che la cute pre-psoriasica adiacente alle lesioni attive e le lesioni precoci sono caratterizzate da una forte espressione della chemerina a livello del derma e dalla presenza di neutrofili CD15+ e di pDC CD123+/BDCA- 2+/ChemR23+. Al contrario, la cute proveniente da lesioni croniche ha presentato una bassa espressione della chemerina, neutrofili segregati in microascessi epidermici e poche pDC nel derma. Poiché l’immunoreattività alla chemerina è risultata associata soprattutto ai fibroblasti, è stata esaminata la produzione di chemerina in vitro da parte di fibroblasti isolati da cute psoriasica o da donatori sani. I risultati ottenuti hanno mostrato che le cellule provenienti da lesioni psoriasiche esprimono livelli di mRNA della chemerina e di proteina più elevati rispetto ai fibroblasti provenienti da cute psoriasica non lesionale o da donatori sani. E’ stato inoltre dimostrato che solo i surnatanti di colture di fibroblasti ottenuti da cute lesionale psoriasica, e non quelli di donatori sani o di cute psoriasica non lesionale, sono in grado di indurre la migrazione delle pDC in vitro in maniera chemerina-dipendente. Sulla base di questi risultati si può affermare che l’espressione della chemerina caratterizza in modo specifico le fasi precoci dell’evoluzione delle lesioni psoriasiche ed è strettamente associata, dal punto di vista temporale, alla presenza delle cellule dendritiche plasmacitoidi nella cute. Si può quindi ipotizzare che l’asse chemerina/ChemR23 possa svolgere un ruolo di rilievo nelle prime fasi di sviluppo della psoriasi. In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi mettono in evidenza l’importanza dell’attivina A e della chemerina nella biologia delle DC. In particolare, è emerso che l’attivina A svolge un ruolo nel differenziamento delle cellule di Langerhans, mentre la chemerina è implicata nel reclutamento delle pDC a livello delle lesioni psoriasiche. Studi ulteriori su quest’ultimo aspetto potranno portare allo sviluppo di strategie di prevenzione o di trattamenti terapeutici precoci della psoriasi.

In this thesis we explored the role of two molecules, activin A and chemerin, in dendritic cell biology. Dendritic cells (DC) represent an heterogeneous population of haematopoietic origin that are specialized in the capture, processing and presentation of antigens to naïve T cells. The interaction of DCs with T cells can lead to different forms of immune response, or to T-cell tolerance, depending on the type of DC and its activation state. Dendritic cell subtypes differ in location, membrane markers, migratory pathways and immunological functions. DCs are classically subdivided into two main categories: conventional dendritic cells (cDC) and plasmacytoid dendritic cells (pDC). Conventional DC already have a dendritic morphology in resting conditions and are located in lymphoid tissues or in peripheral tissues. Of particular interest are Langerhans cells (LCs), that are located in the epidermis where they act as sentinels. Plasmacytoid DC circulate through the blood and lymphoid tissues and only acquire the typical DC morphology after activation, which is accompanied by the release of type I interferons. Ιn vitro, DC can be generated from monocytes in presence of GM-CSF and IL-4 (Mo-DC). When monocytes are cultured in the presence of TGF-β in addition to GMCSF, IL-4, DC are generated displaying markers of LC (langerin and Birbeck granules). The first part of this thesis is centered on activin A, a TGF-β family member involved in skin morphogenesis and wound healing. We analysed activin A production by DC in vitro and we demonstrate that Mo-DC release abundant levels of activin A during the maturation process induced by Toll-like receptor (TLR) agonists, bacteria, TNF and CD40L. Activin A production by Mo-DC is selectively down-regulated by anti-inflammatory molecules such as dexamethasone or IL-10. We also report that activin A induces the differentiation of human monocytes into Langerhans cells in the absence of TGF-β. Activin A-induced LC (ActA-LC) are langerin+, E-cadherin+, CLA+, CCR6+ and Birbeck granules+ and possess typical APC functions. In human skin explants, intradermal injection of activin A increase the number of CD1a+ and Langerin+ cells in both the epidermis and dermis by promoting the differentiation of resident precursor cells. High levels of activin A are present in the upper epidermal layers and in the dermis of lichen planus biopsies in association with a marked infiltration of CD1a+ and Langerin+ cells. It is thus likely that activin A may have a prominent role in LC differentiation in lichen planus. In summary, this study presents a new model in which activin A induces the differentiation of circulating CD14+ cells into LC. Since activin A is abundantly produced during certain inflammatory conditions, we propose that this cytokine represents a new pathway, alternative to TGFβ, responsible for LC differentiation during inflammatory/autoimmune conditions. In the second part of this thesis we analyse the role of chemerin, a new chemotactic factor, in the recruitment of pDC into psoriatic skin. It’s known that psoriasis is characterized by the recruitment of pDC into the skin, but the molecules involved in pDC accumulation in psoriatic lesions are unknown. Chemerin is the only inflammatory chemotactic factor that is active on human blood pDC in vitro. It has been indeed demonstrated that pDC express functional chemerin receptors (namely ChemR23); in fact, pDC are able to respond to a chemerin gradient by migrating across an endothelial cell monolayer in transmigration assays. In this work we analyzed chemerin expression in the skin of psoriatic patients and we observed that prepsoriatic skin adjacent to active lesions and early lesions were characterized by a strong expression of chemerin in the dermis and by the presence of CD15+ neutrophils and CD123+/BDCA-2+/ChemR23+ pDC. Conversely, skin from chronic plaques showed low chemerin expression, segregation of neutrophils to epidermal microabscesses, and few pDC in the dermis. Chemerin expression was localized mainly in fibroblasts, so we examined chemerin production by fibroblasts from psoriatic skin or healty skin in vitro. Fibroblasts cultured from skin of psoriatic lesions expressed higher levels of chemerin messenger RNA and protein than fibroblasts from uninvolved psoriatic skin or healthy donors and promoted pDC migration in vitro in a chemerin-dependent manner. Therefore, chemerin expression specifically marks the early phases of evolving skin psoriatic lesions and is temporally strictly associated with pDC. These results support a role for the chemerin/ChemR23 axis in the early phases of psoriasis development. Altogether, the present results highlight the importance of activin A and chemerin in dendritic cell biology: activin A plays a role in the differentiation of Langerhans cells while chemerin is involved in the recruitment of pDC in skin psoriatic lesions. Further investigations on this topic may lead to development of strategies for prevention or early therapeutic intervention in psoriasis.