The prostate specific membrane antigen, a biomarker of prostate cancer, is endowed with signaling properties that regulates cytokine production and cell survival of prostate cancer cells

Il cancro alla prostata è, fra le varie neoplasie relative alle persone di sesso maschile di età superiore ai 55 anni, la forma tumorale più comune e la seconda causa di morte per tumore nella popolazione maschile dopo il tumore al polmone causando il 13% di tutte le morti per cancro. La prostata è una ghiandola che si trova nella pelvi dell’uomo, e svolge un’ importante funzione legata alla produzione del liquido seminale. E’ organizzata in due compartimenti: il compartimento stromale e il compartimento epiteliale (Coffey, 1993). Le interazioni stroma-epitelio rappresentano un aspetto fondamentale per la corretta organizzazione della ghiandola prostatica. La disregolazione nella comunicazione paracrina tra lo stroma e l’epitelio può contribuire sia allo sviluppo di iperplasie e neoplasie sia ad accelerare il processo di progressione tumorale nella prostata. La neoplasia prostatica è un tumore androgeno-dipendente la cui crescita può essere soppressa in seguito alla deprivazione degli ormoni. Tuttavia, a causa della proliferazione di cellule androgeno indipendenti, il cancro prostatico si trasforma negli anni in androgeno indipendente diventando una malattia altamente metastizzata (Wang et al. 2007). I trattamenti per il cancro prostatico organo-localizzato includono l’intervento chirurgico, la radioterapia, la terapia ormonale. Ad oggi non esistono, invece, trattamenti efficaci contro il cancro prostatico metastatizzato. Negli ultimi anni numerosi studi hanno messo in evidenza come un ruolo prominente nella progressione tumorale può essere attribuita a fattori solubili presenti nel microambiente tumorale. Tra questi, l’interleuchina-6 (IL-6) ha un ruolo fondamentale nella regolazione della proliferazione, dell’apoptosi, dell’angiogenesi e del differenziamento di una serie di tumori incluso il tumore alla prostata (Naka et al., 2002; Trikha M et al., 2003). Infatti, l’espressione di IL-6 e del suo recettore è stata dimostrata nelle linee cellulari prostatiche e colture cellulari primarie isolate da carcinomi prostatici umani (Giri et al., 2001). Clinicamente, i livelli di IL-6 nel siero di pazienti con cancro prostatico allo stadio avanzato, ormone-refrattario sono risultati significatamene elevati (Alder et al., 1999). Accanto a IL-6 anche la chemochina CCL5 (RANTES) sembra essere implicata nella progressione del cancro prostatico. Recentemente, è emerso come CCL5 sia espressa dalle cellule tumorali prostatiche umane (Koning et al., 2004) e come sia in grado di stimolare la loro proliferazione ed invasione (Manes et al., 2003). Molte proteine sono state analizzate per la diagnosi e il trattamento del cancro prostatico. Tra queste il Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA) è diventato oggetto di numerosi studi ed è oggi considerato un importante bio-marcatore nella diagnosi e nel trattamento del cancro alla prostata. PSMA è una proteina transmembrana di tipo II di 100 kDa con un corto dominio citoplasmatico (19 aa), localizzata preferenzialmente nelle cellule epiteliali della ghiandola prostatica (O'Keefe DS et al., 1998). Nelle cellule epiteliali normali l’espressione di PSMA è molto bassa mentre è notevolmente aumentata nei cancri primari alla prostata, nelle metastasi e nei carcinomi prostatici ormone refrattari (Silver et al., 1997) e nelle neo-vascolature associate a molti tumori solidi (Liu et al., 1997). PSMA possiede due distinte attività carbossipeptidasiche sito-specifiche: un’attività neuropeptidasica (NAALADase) e un’attività di folato idrolisi (Pinto et al., 1996). E’ stato riportato che l’inibizione o il “knocking-down” di PSMA modula i processi di adesione/de-adesione o attraverso l’attivazione delle FAK (focal adhesion kinase) in “LNCaP cells” o attraverso l’attivazione di PAK-1 (Rho GTPase effector molecole p21-activated kinase 1) in HUVEC (normal endothelial cells) (Barwe et al., 2007; Ghosh et al., 2005). Basandoci su queste osservazioni e su esempi, riportati in letteratura, riguardanti altre peptidasi enzimatiche in grado di mediare la migrazione cellulare tramite una cascata di segnali, abbiamo supposto che PSMA svolga, non solo funzioni di enzima, ma che sia anche una proteina coinvolta nella sopravvivenza e nella migrazione cellulare. Per il nostro studio abbiamo utilizzato una linea cellulare di carcinoma prostatico, “LNCaP cells”, che esprimono in modo endogeno PSMA. Nella prima parte della ricerca abbiamo dimostrato che l’attivazione di PSMA, ottenuta stimolando le “LNCaP cells” con mAb specifici murini anti-PSMA deguiti da agrregazione con anticorpi policlonali solubili di capra anti-IgG di topo, induceva l’attivazione sequenziale di “small GTP proteins” (Ras e RAC1) e “Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK)” (p38, ERK1/2) e del fattore trascrizionale NF-B. E’ noto che NF-B è uno dei principali fattori trascrizionali per il controllo dell’espressione genica di IL-6 e CCL5 (Mainiero et al., 1998), due fattori solubili che, come detto precedentemente, sono sono stati implicati nella progressione e nell’invasività dei tumori alla prostata. Test ELISA ci hanno permesso di dosare la produzione di IL-6 e CCL5 in “LNCaP cells” stimolate o non tramite il cross-linking di PSMA. In condizioni basali, cioè in assenza di stimoli, la produzione di IL-6 e CCL5 risultava bassa, ma la produzione sia di IL-6 che di CCL5 potevano essere significatamene aumentate in risposta alla stimolazione di PSMA. Per dimostrare che l’espressione genica di IL-6 e CCL5 era controllata dalla cascata di segnalazione indotta dalla stimolazione di PSMA abbiamo utilizzato gli inibitori farmacologici delle chinasi p38 e ERK1/2. L’inibizione di p38 abroga la produzione di IL-6 e CCL5 sia basale che indotta dal reclutamento di PSMA, mentre l’inibizione di ERK1/2 riduce, ma non abroga, la produzione di IL-6 e CCL5. Le osservazioni ottenute hanno dimostrato che l’attivazione di p38 ed ERK1/2 mediata da PSMA ha un ruolo nell’espressione genica dei fattori solubili IL-6 e CCL5. Allo scopo di valutare i potenziali effetti, sulle cellule tumorali prostatiche, dell’aumento dell’espressione di IL-6 e CCL5 indotto dall’attività segnalatoria di PSMA, “LNCaP cells” sono state trattate con diverse dosi di IL-6 e CCL5 umano ricombinante e ne è stata valutata la proliferazione. I dati ottenuti hanno rivelato come entrambi i fattori solubili siano in grado di stimolare, in modo dose dipendente, ma, soprattutto, in modo sinergico la proliferazione delle cellule. Ulteriori studi hanno messo in evidenza, inoltre, come il trattamento con CCL5 ricombinante inducesse proliferazione cellulare tramite l’attivazione di STAT5 e conseguente aumento dell’espressione della ciclica D1. In conclusione i dati ottenuti sottolineano il fatto che PSMA è una proteina con capacità segnalatorie che, in seguito alla sua stimolazione, è in grado di attivare le MAP chinasi con conseguente aumento della produzione di IL-6 e CCL5 a cui si associa un aumento della proliferazione delle cellule tumorali. PSMA potrebbe, pertanto, essere direttamente coinvolta nella disregolazione della proliferazione e della sopravvivenza registrata “in vivo” nelle cellule tumorali. La seconda parte della ricerca si è concentrata sullo studio delle possibili interazioni molecolari tra PSMA e l’integrina beta1 e il ruolo che la filmina potrebbe svolgere in questa interazione. L’analisi al microscopio confocale ha messo in luce una colocalizzazione di PSMA e l’integrina beta1 a livello della membrana plasmatica. Successivamente, tramite esperimenti di co-immunoprecipitazione, abbiamo valutato se PSMA fosse associata all’integrina beta1 e alla filmina. I risultati ottenuti hanno rivelato che PSMA era in grado di co-immunoprecipitare con entrambe le molecole. L’utilizzo di uno specifico anticorpo che riconosce una forma attivata dell’integrina beta1 ci ha permesso poi di investigare, tramite analisi al FACS, la connessione esistente tra PSMA e l’integrina beta1. I dati ottenuti hanno evidenziato come il cross-linking di PSMA inducesse un cambiamento conformazionale, associato ad uno stato di attivazione, nell’integrina beta1 suggerendo un’interazione funzionale tra le due molecole...

Prostate cancer is the most commonly diagnosed neoplasia in man living developed countries. A number of studies have recently demonstrated that a prominent role in tumor survival and progression can be attributed to soluble mediators present in the tumor microenvironment. Among these, Interleukin-6 (IL-6) has a fundamental role in the regulation of proliferation, apoptosis, angiogenesis and differentiation in many cell types and it is also implicated in the development and progression of several forms of tumours including prostate cancer. In fact, the expression of IL-6 and its receptor is consistently demonstrated in human prostate cancer cell lines and in freshly isolated cells from human prostate carcinoma and benign prostate hyperplasia. Clinically, IL-6 levels in serum are significantly elevated in many cases of advanced, hormone-refractory prostate cancer. Recently, the chemokine CCL5 (RANTES) was found to be expressed by human prostate carcinoma cells and it reported to stimulate their proliferation and invasion. Thus, also CCL5 appears to be directly involved in the behaviour of prostate carcinoma cells. The expression levels of the prostate specific membrane antigen (PSMA) have been proposed as a useful indicator of the severity of the disease in prostate cancer. PSMA expression is augmented in high-grade and metastatic tumors. Observations of the clinical behaviour of prostate tumors suggest that increased secretion of IL-6 and CCL5 may correlate to higher expression of PSMA may be correlated. We hypothesized that PSMA is endowed with signalling properties and that its stimulation regulate IL-6 and CCL5 gene expression. We herein demonstrate that cross-linking of cell surface PSMA with specific antibodies activates the small GTPases RAS and RAC1 and the MAPKs p38 and ERK1/2 in prostate carcinoma LNCaP cells. As downstream effects of PSMA- fostered RAS-RAC1-MAPK pathway activation we observed a strong induction of NF-κB activation associated with an increased expression of IL-6 and CCL5 genes. Pharmacological blockade by specific inhibitors revealed that both p38 and ERK1/2 participate in the phenomenon, although a major role exerted by p38 was evident. Finally we demonstrated that IL-6 and CCL5 synergistically enhanced the proliferative potential of LNCaP cells in a dose-dependent manner and that CCL5 functioned by receptor-mediated activation of the STAT5-Cyclin D1 pro-poliferative pathway. The novel PSMA functions described in the present report may have profound influence on the survival and proliferation of prostate tumor cells, accounting for the observation that PSMA overexpression in prostate cancer patients is related to a worse prognosis. Having assessed for the first time that PSMA signal in cancer cells, we next investigated whether a PSMA-beta1 integrin interaction could occur at the plasma membrane. It was reported that in normal endothelial cell like HUVECs, PSMA co-operates with beta1 integrin in the regulation of cytoskeletal dynamics, thanks to the activation of PAK-1 and to the association to Filamin. Confocal microscopy analysis of adherent, non stimulated LNCaP cells confirmed the co-localization of the two molecules, that, in addition, could be co-immune precipitated together with filamin A. Noteworthy, PSMA-cross-linking determined the conformational change of beta1 molecules leading to the exposure of the activation epitopes recognized by the HUTS-21 mAb and the cross-linking of the two molecules at the same time raised the production of IL-6 and CCL5 by LNCaP cells. Although the role of filamin in PSMA-beta1 interactions and the molecular assembly at the plasma membrane still need to be investigated, we think that this newly discovered functions of PSMA and its possible cooperation with beta1 integrin may help in elucidating the biological effects of PSMA, implicating this molecule as an important regulator of prostate tumor cell survival and proliferation. Moreover, in order to determine whether or not the interaction of PSMA with filamin affects its signalling ability, we silenced filamin expression, in LNCaP, by using RNA interfering method. Preliminary results showed a strong decrease of ERK activation of ERK induced by PSMA cross-linking in silenced cells compared to that of the wild type. Collectively, these results are very suggestive of a PSMA-beta1integrin interaction. If so, FLNa could bridge the cytodomains of the two proteins thereby providing PSMA with signalling complex recruited by beta1 integrin. In all, the newly discovered functions of PSMA and its possible cooperation with beta1 integrin may help in elucidating the biological effects of PSMA, implicating this molecule as an important regulator of prostate tumor, cell survival and proliferation.