A role for leukocyte-endothelial adhesion mechanisms in epilepsy

Il presente progetto di ricerca per il Dottorato in Scienze Biomediche Traslazionali ha avuto come obiettivo uno studio sperimentale delle implicazioni del reclutamento leucocitario nella patogenesi e nella evoluzione dell’epilessia. I meccanismi coinvolti nella patogenesi dell’epilessia, una patologia neurologica cronica che colpisce circa l’uno percento della popolazione mondiale, non sono ancora chiari1-3. Tuttavia studi recenti suggeriscono che l’infiammazione potrebbe giocare un ruolo nella patogenesi di questa malattia. Il reclutamento leucocitario è una caratteristica ed un punto di intervento terapeutico fondamentale nell’infiammazione tissutale, ma un ruolo per le interazioni tra leucociti ed endotelio nella patogenesi delle crisi epilettiche non è ancora stato esplorato. Nel presente progetto abbiamo utilizzato un modello murino di epilessia, indotto da pilocarpina, ed abbiamo dimostrato che le crisi inducono a livello dei vasi cerebrali elevata espressione di molecole di adesione vascolari, come vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) e selectine. Mediante la tecnica della microscopia intravitale sono state evidenziate aumentate interazioni (rotolamento ed arresto) in vivo da parte di granulociti e leucociti TH1 con l’endotelio cerebrale dopo le crisi, ed è stato osservato che queste interazioni sono mediate dalla mucina leucocitaria P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) e dalle integrine leucocitarie α4β1 e αLβ2. Il trattamento dei topi con anticorpi bloccanti queste molecole di adesione, ha indotto una drammatica riduzione delle crisi acute e croniche indotte da pilocarpina. Anche la deficienza genetica di PSGL-1 funzionale o di α1-3-fucosiltransferasi, enzimi coinvolti nella glicosilazione del PSGL-1, inibisce le crisi. Per confermare ulteriormente un ruolo dei leucociti nell’induzione delle crisi, abbiamo depleto i granulociti murini prima della somministrazione di pilocarpina e abbiamo nuovamente osservato una consistente riduzione delle crisi acute e di quelle croniche spontanee ricorrenti. La rottura della barriera emato-encefalica (BBB), che, come dimostrato da diversi recenti lavori, è noto aumentare l’eccitabilità neuronale, è stata drasticamente ridotta negli animali trattati con anticorpi anti-integrina α4 o nei topi geneticamente deficienti di PSGL-1 o di fucosiltransferasi. Questo suggerisce un legame patogenetico tra: le interazioni tra leucociti e i vasi cerebrali, il danno di barriera e l’insorgenza delle crisi. Abbiamo infine ottenuto dati che suggeriscono che l’epilessia può essere correlata nei topi con elevate conte di leucociti in preparati immunoistochimici di cervelli dopo crisi. Sono stati inoltre da noi analizzati anche campioni di cervelli umani di pazienti epilettici dove abbiamo confermato una maggiore abbondanza di leucociti nei cervelli epilettici rispetto ai controlli. I nostri risultati indicano le interazioni tra leucociti ed endotelio cerebrale come un target potenziale per la prevenzione ed il trattamento dell’epilessia.

The present project represents an experimental study on the leukocyte recruitment in the induction and evolution of epilepsy. The mechanisms involved in the pathogenesis of epilepsy, a chronic neurological disorder that affects approximately one percent of the general world population, are not well understood1-3, but recent data suggest that inflammation may play a role in the pathogenesis of this disease. Leukocyte recruitment is a hallmark of and a point of therapeutic intervention in tissue inflammation, but a role for leukocyte-endothelial interactions in seizure pathogenesis has not been explored. Using a mouse model of epilepsy, pilocarpine induced, we show that seizures induce elevated expression of vascular cell adhesion molecules, such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and selectins on brain vessels. Intravital microscopy revealed enhanced granulocyte and TH1 lymphocyte interactions (rolling and arrest) in vivo with brain microvasculature after seizures, and these leukocyte-vascular interactions were mediated by the leukocyte mucin P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) and leukocyte integrins α4β1 and αLβ2. Treatment of mice with blocking antibodies dramatically reduced acute and chronic seizures induced by pilocarpine. Genetic deficiency of PSGL-1 or of the α1-3-fucosyltransferases, enzymes involved in the glycosylation of PSGL-1, also inhibited seizures. To further confirm a role for leucocytes in the induction of seizures we performed granulocytes depletion in mice before pilocarpine administration and we again observed a consistent reduction of acute and chronic spontaneous recurrent seizures. Blood-brain barrier (BBB) leakage, which is known to enhance neuronal excitability as shown in different recent articles, was induced by acute seizure activity, but it was drastically reduced in anti-α4 treated or PSGL-1 or FucT deficient animals, suggesting a pathogenetic link between leukocyte-vascular interactions, BBB damage and seizure generation. Finally, we provide data suggesting that epilepsy may be correlated in mice with elevated brain leukocyte counts after seizures. Consistent with the potential leukocyte involvement in epilepsy in humans, leukocytes were more abundant in brains of individuals with epilepsy than in controls. Our results suggest leukocyte-endothelial interaction as a potential target for the prevention and treatment of epilepsy.