Role of coxsakie virus B4 in the pathogenesis of type 1 diabetes mellitus

Il diabete mellito tipo I è una malattia metabolica caratterizzata da iperglicemia, conseguente alla distruzione selettiva delle cellule beta pancreatiche. L’eziologia del diabete mellito tipo I è multifattoriale ed è legata all’interazione fra predisposizione genetica, fattori immunitari e fattori ambientali. L’ipotesi di una patogenesi autoimmune di questa malattia è stata avanzata da molti anni ed è supportata dal riscontro di autoanticorpi nel siero dei pazienti (ICA,GAD,IA2). Si ritiene che il processo sia scatenato o accelerato in un soggetto geneticamente predisposto da agenti ambientali ed in particolare da virus che, come in altre malattie autoimmuni, sembrerebbero implicati mediante un meccanismo di mimetismo molecolare. Numerosi studi supportano l’ipotesi di un’associazione diretta tra l’infezione da parte di enterovirus (ed in particolare il Coxsackievirus virus B4) e disfunzione delle beta cellule pancreatiche nell’uomo. Lo scopo di questo studio è stato quello di identificare sia nuovi target autoantigenici rilevanti dal punto di vista patogenetico sia agenti infettivi coinvolti nella patogenesi della malattia attraverso l’uso di una libreria peptidica. La popolazione studiata include 58 pazienti con diagnosi di diabete mellito tipo 1 all’esordio (35 maschi e 23 femmine), età compresa tra 1–18.7 anni (media = 8.3 ), il secondo gruppo include 30 bambini sani di pari età e sesso. La libreria peptidica e’ una metodica per l’identificazione di ligandi degli anticorpi in una determinata malattia autoimmune quando l’autoantigene non e’ noto. Questo approccio identifica epitopi lineari e conformazionali e puo’ essere usato per analizzare target antigenici specifici di malattia attraverso un pool di immunoglobuline sieriche ottenute da piu’ pazienti affetti dalla medesima patologia. Abbiamo pertanto testato una libreria peptidica con un pool di immunoglobuline IgG derivate dal siero dei pazienti e dei controlli. Al termine della procedura abbiamo ottenuto un peptide che è stato sintetizzato e testato mediante ELISA sul siero di ogni paziente. Gli anticorpi IgG purificati contro il peptide identificato sono stati ottenuti dal siero dei pazienti mediante processo di dialisi su colonna di sefarosio. Il peptide identificato è stato comparato con le sequenze di proteine virali e batteriche note, attraverso BLAST (basic local alignment search tool program-tramite il National Center for Biotechology Information-NCBI) ed è emerso che questo peptide mostra numerose similitudini con la proteina virale VP1 espressa sul capside virale del Coxsackievirus. Questo peptide di 12 amminoacidi (da noi chiamato T1DM) è riconosciuto dal 74% (43/58) dei sieri dei pazienti ma da nessuno dei sieri dei controlli (p<0.0001). Una simile percentuale di sieri riconosce la proteina VP1 del Coxsackie B4. Il peptide virale omologo al peptide T1DM è stato da noi chiamato peptide Coxsa. Abbiamo quindi comparato la sequenza del peptide T1DM con le sequenze di proteine umane note (attraverso BLAST) e abbiamo evidenziato un’alta omologia di sequenza con alcuni domini di tre proteine umane presenti nelle cellule beta pancreatiche: la fogrina (una proteina localizzata nei granuli secretori contenti l’insulina delle cellule beta ed espressa in superficie con la secrezione di insulina ), la 6 fosfofrutto chinasi (6PKF- un enzima che catalizza uno step importante della glicolisi) ed il canale del calcio che nella cellula beta pancreatica è di fondamentale importanza nella secrezione di insulina. Abbiamo rilevato che gli anticorpi contro il peptide T1DM riconoscono il peptide Coxsa e legano la proteina VP1 del virus Coxsackie; nello stesso modo gli anticorpi anti peptide T1DM a anti peptide Coxsa riconoscono la fogrina, la 6PKF ed il canale del calcio e legano la fogrina e la 6PKF delle cellule pancreatiche murine (evidenziato mediante FACS). Attraverso il test dell’apoptosi abbiamo inoltre mostrato che gli anticorpi contro il peptide T1DM e contro il peptide Coxsa inducono apoptosi delle cellule beta pancreatiche. Questo studio risulta particolarmente importante perché permette di ipotizzare che il virus coxsackie B4 possa indurre una risposta immune contro la proteina VP1 cross-reattiva con auto antigeni attraverso un meccanismo di mimetismo molecolare, portando alla distruzione delle cellule beta fino all’esordio clinico del diabete mellito tipo 1.

Aetiopathogenesis of Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) includes genetic, immunologic and environmental factors. An autoimmune origin had been suggested based on the findings of auto-antibodies (ICA,GAD,IA2). Among enviromental factors interesting findings on the role played by Enteroviruses, such as Coxsackie B4, have been reported. However much more data are necessary to establish a clear association between viruses and T1DM in humans. To identify pathogenetically relevant autoantigens targets in patients with T1DM and to evaluate the possible involvement infection agents in the pathogenesis of T1DM we used a peptide library approch. We enrolled 58 patients (35 M, 23 F) aged 0.8-18.7 years with newly-diagnosed T1DM and 30 healthy age-and sex matched individuals as controls. We screened a random peptide library with a pool of immunoglobulins G derived from sera of patients and controls. A set of peptides, obtained from the last biopanning round, was synthetized and used in an ELISA assay to test individual patients’ sera as well as control IgG immunoglobulins. We identified an immunodominant peptide of 12 aa (that we call peptide T1DM) that was recognised by 43/58 (74%) of patients' sera but by none of the controls’sera. The peptide was compared with know microbial sequences using BLAST network service. We found hight degree of homology with viral VP1, a protein expressed on Coxsackie virus capside (the omologus peptide was called Coxsa peptide). IgG antibodies against the T1DM peptide were affinity purified from patients' sera and were able to recognise the viral protein VP1 and the Coxsa peptide. We then compare the peptide T1DM sequence with know human sequence using BLAST network service and found hight degree of homology with three human proteins in beta cells: phogrin (a protein localized in secretory granules of beta cells), 6-phosphofructo-1-kinase (6PKF an enzyme that catalyzes an important step of glycolysis) and L-type calcium channel that in beta cell is of great importance in insulin secretion. Anti T1DM and anti Coxa peptides antibodies recognized phogrin, 6PKF and L-type calcium channel by immunoprecipitetion of beta cell lysates and bind phogrin and 6PKF (demonstred using FACS analysis) in beta cells. Finally we found that antipeptides antibodies were able to induce apoptosis of pancreatic beta cells. Therefore we suggest that in genetically predisposed subjets Coxsackievirus virus B4 infection may induce an antiviral response able to trigger destruction of beta cells through a molecular mimicry mechanism between VP1 protein of coxsackie virus B4 and human autoantigens (phogrin, 6PKF and L-type calcium channel) leading to the onset of type 1 diabetes mellitus.