L’impiego di agenti citotossici capaci di riconoscere in modo specifico molecole presenti sulla superficie di una cellula tumorale rappresenta una tecnica molto promettente per il trattamento di diverse neoplasie ed è particolarmente efficace per la cura di leucemie e linfomi. Appartengono a questa classe di sostanze le immunotossine, proteine composte da un dominio di derivazione anticorpale e da un dominio tossico solitamente di origine batterica o vegetale: l’anticorpo lega selettivamente l’antigene bersaglio e, a seguito di endocitosi, consente il rilascio all’interno della cellula della componente tossica che interferisce con i processi metabolici necessari alla sopravvivenza cellulare. Tra i diversi marcatori di superficie associati a leucemie e linfomi, uno dei target molecolari di maggior interesse per questo tipo di approccio terapeutico, è il CD22, una glicoproteina di membrana con funzioni co-recettoriali la cui espressione è limitata ai linfociti B. Il presente lavoro di tesi descrive la generazione e la successiva caratterizzazione funzionale di una immunotossina in cui il motivo di legame alla superficie cellulare è costituito da un frammento anticorpale a singola catena (scFv) specifico per l’antigene CD22, mentre l’azione citotossica è svolta da una forma tronca dell’esotossina A di Pseudomonas aeruginosa, proteina in grado di inibire il meccanismo di sintesi proteica eucariotica. Attraverso il clonaggio delle sequenze codificanti per le regioni variabili della catena pesante (VH) e della catena leggera (VL) di un anticorpo monoclonale murino anti-CD22, è stato possibile assemblare il costrutto che codifica per l’scFv ed esprimere la proteina ricombinante in un sistema di espressione eterologo quale Escherichia coli. Mediante analisi di immunofluorescenza e saggi immunoenzimatici è stato verificato che il frammento anticorpale possiede una buona affinità di legame all’antigene e mantiene le stesse caratteristiche di specificità mostrate dall’anticorpo monoclonale parentale. Successivamente l’scFv è stato unito attraverso fusione genetica al dominio enzimatico della tossina batterica. L’immunotossina risultante, espressa in Escherichia coli, è stata estratta a partire da aggregati insolubili accumulati nel compartimento citosolico del batterio e purificata tramite cromatografia di affinità con rese di circa 1-2 mg per litro di coltura batterica. La proteina ricombinante possiede proprietà di legame specifiche per l’antigene non dissimili da quelle osservate per l’scFv, inoltre, secondo quanto accertato mediante saggi di citotossicità, induce in modo selettivo l’inibizione della proliferazione di linee cellulari esprimenti la proteina CD22 con una IC50 di 1- 10 nM (per IC50 si intende la concentrazione in grado di inbire il 50% della proliferazione IV cellulare). Essa sembra quindi conservare inalterate sia le caratteristiche di riconoscimento specifico del frammento anticorpale che l’attività enzimatica della tossina. Ulteriori studi serviranno a valutare l’opportunità di sottoporre l’immunotossina ad un processo di ottimizzazione finalizzato all’ottenimento di un nuovo farmaco biotecnologico per il trattamento di neoplasie ematologiche nell’uomo.

The use of cytotoxic agents capable to selectively target surface molecules on a malignant cell is a promising approach for the treatment of cancer, especially hematologic malignacies. Immunotoxins, in particular, are polypeptides comprising an antibody-derived domain and a toxic portion, usually represented by a bacterial or plant toxin: the antibody specifically binds a target antigen and, following endocytosis, delivers the toxic payload to the interior of the cell, interfering with fundamental metabolic pathways. Among several leukemia/lymphoma-associated surface antigens, one of the most attractive molecular targets for this kind of therapeutic strategy is CD22, a membrane glycoprotein with coreceptor functions, whose expression is restricted to B lymphocytes. The present thesis describes the construction and characterization of a recombinant immunotoxin in which the binding domain is represented by a CD22-specific single-chain antibody fragment (scFv), while the cytotoxic activity is carried out by a truncated version of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, a bacterial toxin that inhibits the mechanism of protein synthesis in eukaryotes. Through the molecular cloning of sequences coding for the variable domains of heavy and light chains (VH and VL, respectively) of an anti-CD22 murine monoclonal antibody, it was possible to assemble a plasmid construct coding for a scFv that was eventually produced in a bacterial expression system. Immunofluorecence analysis on CD22-positive cells and immunoenzymatic assays on the purified antigen proved that the antibody fragment maintains the binding specificity of the parental monoclonal antibody, exhibiting a fairly good affinity for CD22. The scFv was later genetically fused to the enzymatic domain of a bacterial toxin. The resulting immunotoxin was expressed in Escherichia coli and recovered from insoluble cytoplasmic aggregates after purification by affinity chromatography, with yields of 1-2 mg from a 1 litre culture. The binding properties of the recombinant immunotoxin are comparable to those of the scFv; V moreover, as ascertained through cell-proliferation assays, it can selectively poison CD22- expressing cells with an IC50 (i.e. concentration inhibiting 50% of the maximal cell proliferation) around 1-10 nM. It can be concluded that our anti-CD22 immunotoxin combines the binding qualities of the scFv antibody and the potent enzymatic activity of the bacterial toxin. After further characterization we will explore the opportunity to start a process of molecular optimization, aiming at the construction of a novel biotechnological drug for the treatment of hematological malignancies in humans.

Construction of a macromolecular recombinant drug for the targeted therapy of hematological malignancies

DELLA CRISTINA, Pietro Argeo
2009-01-01

Abstract

The use of cytotoxic agents capable to selectively target surface molecules on a malignant cell is a promising approach for the treatment of cancer, especially hematologic malignacies. Immunotoxins, in particular, are polypeptides comprising an antibody-derived domain and a toxic portion, usually represented by a bacterial or plant toxin: the antibody specifically binds a target antigen and, following endocytosis, delivers the toxic payload to the interior of the cell, interfering with fundamental metabolic pathways. Among several leukemia/lymphoma-associated surface antigens, one of the most attractive molecular targets for this kind of therapeutic strategy is CD22, a membrane glycoprotein with coreceptor functions, whose expression is restricted to B lymphocytes. The present thesis describes the construction and characterization of a recombinant immunotoxin in which the binding domain is represented by a CD22-specific single-chain antibody fragment (scFv), while the cytotoxic activity is carried out by a truncated version of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, a bacterial toxin that inhibits the mechanism of protein synthesis in eukaryotes. Through the molecular cloning of sequences coding for the variable domains of heavy and light chains (VH and VL, respectively) of an anti-CD22 murine monoclonal antibody, it was possible to assemble a plasmid construct coding for a scFv that was eventually produced in a bacterial expression system. Immunofluorecence analysis on CD22-positive cells and immunoenzymatic assays on the purified antigen proved that the antibody fragment maintains the binding specificity of the parental monoclonal antibody, exhibiting a fairly good affinity for CD22. The scFv was later genetically fused to the enzymatic domain of a bacterial toxin. The resulting immunotoxin was expressed in Escherichia coli and recovered from insoluble cytoplasmic aggregates after purification by affinity chromatography, with yields of 1-2 mg from a 1 litre culture. The binding properties of the recombinant immunotoxin are comparable to those of the scFv; V moreover, as ascertained through cell-proliferation assays, it can selectively poison CD22- expressing cells with an IC50 (i.e. concentration inhibiting 50% of the maximal cell proliferation) around 1-10 nM. It can be concluded that our anti-CD22 immunotoxin combines the binding qualities of the scFv antibody and the potent enzymatic activity of the bacterial toxin. After further characterization we will explore the opportunity to start a process of molecular optimization, aiming at the construction of a novel biotechnological drug for the treatment of hematological malignancies in humans.
2009
macromolecular recombinant drug; targeted therapy of hematological malignancies
L’impiego di agenti citotossici capaci di riconoscere in modo specifico molecole presenti sulla superficie di una cellula tumorale rappresenta una tecnica molto promettente per il trattamento di diverse neoplasie ed è particolarmente efficace per la cura di leucemie e linfomi. Appartengono a questa classe di sostanze le immunotossine, proteine composte da un dominio di derivazione anticorpale e da un dominio tossico solitamente di origine batterica o vegetale: l’anticorpo lega selettivamente l’antigene bersaglio e, a seguito di endocitosi, consente il rilascio all’interno della cellula della componente tossica che interferisce con i processi metabolici necessari alla sopravvivenza cellulare. Tra i diversi marcatori di superficie associati a leucemie e linfomi, uno dei target molecolari di maggior interesse per questo tipo di approccio terapeutico, è il CD22, una glicoproteina di membrana con funzioni co-recettoriali la cui espressione è limitata ai linfociti B. Il presente lavoro di tesi descrive la generazione e la successiva caratterizzazione funzionale di una immunotossina in cui il motivo di legame alla superficie cellulare è costituito da un frammento anticorpale a singola catena (scFv) specifico per l’antigene CD22, mentre l’azione citotossica è svolta da una forma tronca dell’esotossina A di Pseudomonas aeruginosa, proteina in grado di inibire il meccanismo di sintesi proteica eucariotica. Attraverso il clonaggio delle sequenze codificanti per le regioni variabili della catena pesante (VH) e della catena leggera (VL) di un anticorpo monoclonale murino anti-CD22, è stato possibile assemblare il costrutto che codifica per l’scFv ed esprimere la proteina ricombinante in un sistema di espressione eterologo quale Escherichia coli. Mediante analisi di immunofluorescenza e saggi immunoenzimatici è stato verificato che il frammento anticorpale possiede una buona affinità di legame all’antigene e mantiene le stesse caratteristiche di specificità mostrate dall’anticorpo monoclonale parentale. Successivamente l’scFv è stato unito attraverso fusione genetica al dominio enzimatico della tossina batterica. L’immunotossina risultante, espressa in Escherichia coli, è stata estratta a partire da aggregati insolubili accumulati nel compartimento citosolico del batterio e purificata tramite cromatografia di affinità con rese di circa 1-2 mg per litro di coltura batterica. La proteina ricombinante possiede proprietà di legame specifiche per l’antigene non dissimili da quelle osservate per l’scFv, inoltre, secondo quanto accertato mediante saggi di citotossicità, induce in modo selettivo l’inibizione della proliferazione di linee cellulari esprimenti la proteina CD22 con una IC50 di 1- 10 nM (per IC50 si intende la concentrazione in grado di inbire il 50% della proliferazione IV cellulare). Essa sembra quindi conservare inalterate sia le caratteristiche di riconoscimento specifico del frammento anticorpale che l’attività enzimatica della tossina. Ulteriori studi serviranno a valutare l’opportunità di sottoporre l’immunotossina ad un processo di ottimizzazione finalizzato all’ottenimento di un nuovo farmaco biotecnologico per il trattamento di neoplasie ematologiche nell’uomo.
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