Expression, purification and structural characterization of human lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS)

La prostaglandina D sintasi di tipo lipocalinico (L-PGDS) catalizza, in presenza di composti sulfidrilici, l’isomerizzazione del gruppo 9,11 endoperossido della PGH2 (Prostaglandina H2) nei gruppi 9-idrossi e 11-cheto della PGD2 (Prostaglandina D2). La PGH2 è il precursore comune di tutti i prostanoidi, i quali comprendono trombossani, prostacicline e prostaglandine. La PGD2 è sintetizzata sia nel sistema nervoso centrale che nei tessuti periferici dove è coinvolta nel mantenimento della temperatura corporea, nella regolazione del corretto funzionamento delle cellule nervose e del ciclo sonno-veglia. E’ inoltre implicata nella sensibilità al dolore, nell’asma allergica, nell’inibizione dell’aggregazione delle piastrine e nel reclutamento chemotattile delle cellule del sistema immunitario. La L-PGDS appartiene alla famiglia delle lipocaline ed è in grado di trasportare piccole molecole idrofobiche; è inoltre la prima proteina di questa famiglia ad essere stata identificata come enzima. Recentemente si è scoperto che la L-PGDS era già conosciuta con il nome di proteina β-trace, la quale nel fluido cerebro spinale rappresenta la seconda proteina per abbondanza. La presenza della L-PGDS è stata individuata anche nel cervello, nei testicoli e prostata umani, nelle cellule della placenta, nel tessuto cardiaco e anche in macrofagi infiltrati in placche aterosclerotiche. In questi tessuti la L-PGDS è coinvolta sia in numerose attività fisiologiche che in risposta a patologie come diabete, lesioni cardiovascolari, sclerosi multipla, malattia di Alzheimer e varie neoplasie. Attualmente i maggiori studi biochimici e strutturali presenti in letteratura riguardano la L-PGDS ricombinante di ratto. Lo scopo di questo lavoro riguarda l’espressione, la purificazione e la cristallizzazione della L-PGDS ricombinante umana allo scopo di risolverne la struttura tridimensionale utilizzando la diffrazione di raggi X. La L-PGDS umana WT e tre mutanti (C65A; C65A/K59A; C89/186A) sono stati espressi in cellule di E. coli e successivamente purificati mediante cromatografia di affinità, con resina di chitina, seguita da gel filtrazione e cromatografia ad interazione idrofobica. Il protocollo di purificazione è stato ottimizzato al fine di ottenere una proteina estremamente pura e di conseguenza adatta ad esperimenti di cristallizzazione. Le soluzioni di cristallizzazione sono state migliorate per ottenere cristalli di ordine e dimensioni tali da poter essere utilizzati in esperimenti di diffrazione di raggi X mediante sorgente ad anodo rotante. La struttura tridimensionale è stata risolta mediante la sostituzione isomorfa multipla e i derivati di atomi pesanti sono stati ottenuti mediante la tecnica del soaking. All’interno della cavità della L- PGDS-C65A si è notata una densità elettronica residua che sembrava interagire con la lisina 59. In quel momento, con i dati a disposizione, non è stato possibile caratterizzare la molecola sconosciuta sebbene siano stati provati numerosi protocolli, compreso l’uso di ligandi fisiologici. La cavità della L-PGDS-C65A/K59A risulta completamente libera. Si è notato come i cristalli della L-PGDS-C65A/K59A crescano in assenza di PEG come precipitante, il quale è, al contrario, necessario per la crescita dei cristalli della L-PGDS-C65A. Questo fatto indica come proprio il PEG potrebbe essere la molecola presente all’interno della cavità. Una parziale conferma a questa ipotesi è arrivata dall’esperimento di seeding nel quale la L-PGDS-C65A/K59A, fatta cristallizzare con semi e nelle condizioni della L-PGDS-C65A, presenta la medesima densità residua all’interno della cavità. Si è potuta definitivamente confermare la nostra ipotesi grazie ad una raccolta ad alta risoluzione della L-PGDS-C65A nella quale la densità residua risulta meglio definita e conforme ad una molecola di PEG. Un altro importante risultato è stato ottenuto dalla parziale risoluzione della struttura tridimensionale del complesso tra la L-PGDS-C65A/K59A e il peptide β amiloide (1-40), infatti è la prima volta che si raggiunge la prova strutturale di questa interazione. La L-PGDS wild type e la L-PGDS-C89/186A, da noi purificate, si sono rivelate non omogenee e non è stato ottenuto nessun cristallo in tutte le prove effettuate.

Lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) catalyzes the isomerisation of the 9,11-endoperoxide group of PGH2 (Prostaglandin H2) to produce PGD2 (Prostaglandin D2) with 9-hydroxy and 11-keto groups in the presence of sulphydryl compounds. PGH2 is a common precurson of all prostanoids, which include thromboxanes, prostacyclins and prostaglandins. PGD2 is synthesized in both the central nervous system and the peripheral tissues where it is involved in the maintenance of the body temperature, regulation of nerve cell function, regulation of the sleep wake cycle, tactile pain sensitivity, allergic asthma, inhibition of platelet aggregation and chemotactic recruitment of inflammatory cells. L-PGDS belongs to the lipocalin family and it is able to bind and transport small hydrophobic molecules; it is also the first member of this important family to be recognized as an enzyme. Recently L-PGDS was identified to be already known as the β-trace protein, which is the second most abundant protein in human cerebro-spinal fluid. L-PGDS is also detected in brain, human testis and prostate, endothelial cells, placenta cells, heart tissue and even in macrophages infiltrated to atherosclerotic plaques. In those tissues L-PGDS is involved in many physiological activities as well as in the response to diseases such as diabetes, cardiovascular lesions, multiple sclerosis, Alzheimer’s disease and tumors. Currently the main structural and biochemical studies, present in the literature, concern recombinant rat and mouse L-PGDS. The aim of this work was to express, purify and crystallize recombinant human L-PGDS in order to solve its three-dimensional structure by X-ray diffraction experiments. Wild type human L-PGDS and three mutants (C65A; C65A-K59A; C89/186A) were expressed using E. coli cell strains and subsequently purified by a chitin affinity column, size exclusion chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The purification method was improved to obtain highly homogeneous protein suitable for preliminary crystallization trials. Crystallization conditions were optimized to obtain large and highly ordered crystals that were tested by X-ray diffraction using either a rotating-anode generator or a synchrotron source. The multiple isomorphous replacement technique was used to solve the phase problem and heavy atom derivatives were obtained by soaking. An unidentified electron density was observed that seemed to interact with lysine 59 inside the L-PGDS-C65A cavity. It was not possible, at that moment, to characterize this residual molecule although different protocols were tested, including the use of physiological ligands. The L-PGDS-C65A/K59A structure showed a completely free cavity. It was noticed that L-PGDS-C65A/K59A crystals grew without PEG as precipitant, which instead was necessary for the L-PGDS-C65A crystals, suggesting that PEG could be the foreign molecule. A seeding experiment of L-PGDS-C65A/K59A crystal, grown in L-PGDS-C65A crystallization conditions, partially confirmed this hypothesis since the foreign molecule was present in the L-PGDS-C65A/K59A cavity. A high resolution data set of a L-PGDS-C65A gave us the possibility to well define the boundaries of the unknown electron density showing that the foreign molecule was probably PEG. An important crystal structure was obtained by mixing L-PGDS-C65A/K59A with the amyloid β peptide (1-40). Although structure refinement is work in progress, it was the first structural evidence of the interaction of L-PGDS with the amyloid β peptide (1-40). Wild type L-PGDS and L-PGDS C89/186A were purified but they were not homogeneous and no crystals grew in any of the crystallization trials.