Ruolo dell'11β-idrossisteroidodeidrogenasi tipo 1 nella sindrome dell'ovaio policistico

Il gene HSD11B1 codifica per l’enzima 11b-idrossisteroido deidrogenasi tipo 1 (11b-HSD1) che catalizza la conversione del metabolita inattivo cortisone in cortisolo, amplificando l’attivazione dei recettori dei glucocorticoidi, particolarmente a livello del fegato e del tessuto adiposo. Molte malattie sono state associate sia ad una aumentata che ad una ridotta attività dell’ 11b-HSD1. Un esempio di aumentata attività dell’ 11b-HSD1 e quindi da eccesso di glucocorticoidi è la sindrome di Cushing, che è associata ad obesità centrale, ipertensione arteriosa e intolleranza glucidica, che nel loro insieme costituiscono la sindrome metabolica. Il ruolo centrale dell’ 11b-HSD1 nella sindrome metabolica è enfatizzato dagli studi sui topi transgenici, dove, una iper-espressione dell’ 11b-HSD1 nel fegato o nel tessuto adiposo determina la comparsa della sindrome metabolica, mentre, al contrario, l’inibizione o la distruzione dell’ 11b-HSD1 ne migliora tutte le caratteristiche. In studi sull’uomo l’obesità è stata associata ad una aumentata espressione dell’ 11b-HSD1 nel tessuto adiposo. Al contrario, alcuni dei pochi studi eseguiti nelle donne con sindrome dell’ ovaio policistico (PCOS) hanno messo in evidenza una ridotta attività dell’11b-HSD1 che è stata associata, attraverso la aumentata clearance metabolica del cortisolo, ad una iperattivazione compensatoria dell’ asse ipotalamo-ipofisi-surrene, e quindi ad un iperandrogenismo surrenalico. Questi studi hanno però come limite il fatto di aver valutato l’ attività dell’ 11b-HSD1 attraverso il dosaggio dei metaboliti urinari del cortisolo e del cortisone. I limiti di questa analisi, che rendono conto della inconsistenza dei risultati di questi studi, sono legati al fatto che il dosaggio dei metaboliti urinari del cortisolo e del cortisone riflettono, più che l’ attività dell’ 11b-HSD1, il bilancio delle attività opposte dell’ 11b-HSD1 e dell’ 11b-HSD tipo 2, e delle attività delle reduttasi. Inoltre, questa tecnica non è in grado di discriminare tra le attività tessuto-specifiche dell’ 11b-HSD1, recentemente osservate nell’obesità. Diversi fattori ormonali e nutrizionali sembrano regolare l’ espressione dell’ 11b-HSD1. Inoltre, esistono comuni polimorfismi di singolo nucleotide (SNP) del gene HSD11B1 che potrebbero contribuire geneticamente alle variazioni inter-individuali nella generazione di cortisolo. In particolare, due SNPs, uno localizzato nella regione del promotore (rs846910, A ® G, ‘SNP 1’) and l’altro nel terzo introne (rs12086634, G ® T, ‘SNP5’), sono stati associati indipendentemente con l’insulino-resistenza, il diabete tipo 2, e l’ipertensione arteriosa, ma non con l’obesità nella maggior parte delle popolazioni studiate. Viceversa, l’allele G dello SNP5, cha causa una ridotta espressione di 11b-HSD1 in vitro, è stato associato all’iperandrogenismo surrenalico nelle donne magre con PCOS. La PCOS è caratterizzata da una elevata prevalenza della sindrome metabolica, ma il ruolo giocato dall’ HSD11B1 è al momento sconosciuto. In aggiunta, sono al momento sconosciuti anche le conseguenze degli SNPs sulla espressione e l’attività dell’ 11b-HSD1 in vitro (con l’eccezione dello SNP5) ed in vivo. In un campione di tessuto adiposo sottocutaneo l’ allele A dello SNP5 è stato recentemente associato a bassi livelli di mRNA di 11b-HSD1. Tuttavia, questo dato non è stato confermato in un altro studio nel quale sono stati analizzati 61 Indiani Pima. Non è stata inoltre rilevata alcuna associazione tra il genotipo dello SNP5 e il rapporto urinario dei metaboliti del cortisolo e del cortisone. L’obiettivo del presente studio è stato pertanto quello di stabilire le conseguenze dei polimorfismi SNP1 e SNP5 sulle caratteristiche della sindrome metabolica e della PCOS, e di definire la loro influenza sulla attività totale corporea e tessuto-specifica (adipose ed epatica) dell’ 11b-HSD1. Abbiamo pertanto genotipizzato una coorte di 600 donne di cui 300 con PCOS e 300 controlli, nelle quali è stata eseguita una attenta valutazione delle variabili metaboliche ed endocrine. Successivamente, sono state richiamate 40 donne, 20 PCOS e 20 controlli, di analogo genotipo e simili il più possibile per età e peso corporeo, per effettuare, in uno studio caso-controllo, la valutazione dettagliata dell’attività, in vivo, dell’ 11b-HSD1 genotipo correlata. L’ attività totale corporea dell’ 11b-HSD1 è stata valutata misurando la quantità di 9,12,12-2H3-cortisolo (d3-cortisolo) prodotta durante l’infusione di 9,11,12,12-2H4-cortisolo. L’attività epatica di 11b-HSD1 è stata quantificata attraverso la misurazione della generazione di cortisolo a seguito della somministrazione orale di cortisone 25mg previa soppressione con desametazone, mentre l’attività dell’ 11b-HSD1 a livello del tessuto adiposo sottocutaneo è stata quantificata, in vitro, attraverso la misurazione della conversione di 1,2,6,7-3H-cortisolo a cortisone (attività deidrogenasica). Negli stessi omogenati ottenuti dalle biopsie del tessuto adiposo è stato quantificato anche l’mRNA di 11b-HSD1. Nell’intera coorte studiata abbiamo trovato una frequenza allelica di A per lo SNP1 del 4% e di G per lo SNP5 del 15%, mentre nessun partecipate allo studio è risultato omozigote per l’allele A dello SNP1. La frequenza dello SNP1 e SNP5 e degli aplotipi di entrambi gli SNPs GATT, GGTT, GATG, e GGTG non differivano tra i casi di PCOS e i controlli. Inoltre, pochi soggetti presentavano gli aplotipi GAGG (n= 1) e GGGG (n= 11) e questo ci ha portato ad escluderli dalle analisi successive. Con interesse abbiamo riscontrato che, sebbene lo SNP considerato singolarmente non avesse un impatto importante sul fenotipo della popolazione analizzata, tuttavia era presente un effetto evidente dell’aplotipo, in particolare dell’aplotipo GATT. Infatti, i soggetti eterozigoti per l’allele A dello SNP1 ed omozigoti per l’ allele T dello SNP5 (aplotipo GATT) presentavano i valori più elevati di circonferenza vita, particolarmente nel gruppo di PCOS, livelli più elevati di risposta insulinica alla curva da carico di glucosio, e maggiori valori circolanti delle transaminasi e dei trigliceridi. L’associazione dei questo aplotipo del gene HSD11B1 con un quadro metabolico peggiore veniva confermata dalla dimostrazione che la quantità di soggetti affetti da sindrome metabolica in accordo ai criteri NCEP-ATPIII era significativamente maggiore entro l’aplotipo GATT rispetto agli altri aplotipi (42.3% verso 18% nell’intera popolazione), senza distinzione tra PCOS e controlli. Non erano invece evidenti importanti associazioni tra l’aplotipo del gene HSD11B1 e il pattern ormonale. I soggetti con l’aplotipo GATT presentavano inoltre non solo un aumentato rapporto urinario di (THF+-THF)/THE (studio sull’intera popolazione di 600 donne), suggerendo una aumentata conversione totale corporea del cortisone a cortisolo, ma anche, durante il test di infusione del cortisolo tetradeuterato (studio sulla popolazione di 40 soggetti), una aumentata produzione di cortisolo, riflesso della combinazione della secrezione surrenalica di cortisolo e della rigenerazione di cortisolo ad opera della 11-HSD1, e di d3-cortisolo, espressione esclusivamente del contributo dell’ 11-HSD1. La quantità di cortisolo e di d3-cortisolo prodotta durante il test di infusione del cortisolo tetradeuterato non differiva tra PCOS e controlli. Tuttavia, le donne con PCOS presentavano un maggiore livello di trascritto di 11b-HSD1 a livello del tessuto adiposo sottocutaneo, particolarmente all’interno dell’ aplotipo GATT. L’attività epatica dell’ 11b- HSD1, invece, non differiva tra gli aplotipi, ma era ridotta nelle PCOS. Inoltre, l’espressione intraadiposa di 11b-HSD1 era significativamente correlata con i valori di insulina a digiuno e gli indici di insulino-sensibilità. In conclusione, questo studio dimostra che l’ aplotipo GATT del gene HSD11B1 è associato alla sindrome metabolica nella popolazione generale, verosimilmente attraverso l’ aumentata attività totale corporea dell’ enzima 11-HSD1. Inoltre, lo stesso aplotipo enfatizza la differenza tra PCOS e controlli in termini di espressione/attività dell’ 11-HSD1 tessuto-specifica, che risulta maggiore a livello intra-adiposo e minore a livello epatico. La maggiore espressione dell’ 11-HSD1 intra-adiposa potrebbe essere uno dei meccanismi di associazione tra PCOS e sindrome metabolica attraverso l’insulino-resistenza. Inoltre, nel presente studio abbiamo valutato anche l’effetto di due polimorfismi del gene HSD11B1 a livello dell’ espressione di 11b-HSD1: lo SNP1 e lo SNP rs13306421, un raro polimorfismo identificato in una popolazione giapponese situato in posizione -2 rispetto al sito di inizio della traduzione (SNP-2). Non abbiamo trovato nessun effetto dello SNP1. Questo risultato ci ha portato ad ipotizzare che questo SNP possa essere in linkare disequilibrium con un polimorfismo funzionale. Abbiamo invece trovato che il polimorfismo SNP-2 è in grado di alterare l’efficienza dell’ inizio della traduzione di 11-HSD1, ed in particolare abbiamo rilevato che l’allele A è associato ad una attività enzimatica maggiore e ad una maggiore quantità di enzima sintetizzato in vitro. Tuttavia, la frequenza allelica di G per lo SNP-2 è risultata del 100% nella nostra popolazione, sollevando il dubbio se questo sia realmente un polimorfismo, oppure se possa essere più propriamente considerato una mutazione. Infatti, sebbene l’allele A sia stato descritto originariamente in un 5% della popolazione giapponese, in uno studio recente in cui sono stati genotipizzati per lo SNP-2 210 soggetti appartenenti a quattro diverse popolazioni (Nigeriana, Giapponese, Cinese e Caucasica) nessuno è stato rivelato essere portatore dell’allele A. Pertanto, sono necessari ulteriori studi finalizzati a dimostrare se l’ allele A sia di fatto un polimorfismo.

HSD11B1 encodes the enzyme 11b-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11b-HSD1) which catalyses regeneration of cortisol from its inactive metabolite cortisone, thereby amplifying glucocorticoid receptor activation, e.g. in liver and adipose tissue. Both increased and decreased 11b-HSD1 activity has been associated with common disease. Glucocorticoid excess, e.g. in Cushing’s syndrome, is associated with features of the Metabolic Syndrome, including central obesity, hypertension and glucose intolerance. Transgenic overexpression of 11b-HSD1 in liver or adipose tissue in mice induces elevated local glucocorticoid concentrations and features of Metabolic Syndrome, while inhibition or disruption of 11b-HSD1 ameliorates features of the Metabolic Syndrome. In human obesity, 11b-HSD1 expression is increased in adipose tissue. In contrast, decreased 11b-HSD1 results in impaired regeneration of cortisol and hence increased metabolic clearance rate for cortisol; the resulting compensatory activation of the hypothalamicpituitary- adrenal axis may be responsible for adrenal androgen excess in some patients with polycystic ovary syndrome (PCOS). The few studies performed until now to estimate 11b-HSD1 activity in vivo in PCOS rely on the ratio of metabolites of cortisol and cortisone in urine. There are many flaws to this, which can explain the lack of consistency between the studies. This assay, in fact, reflects not just 11b-HSD1 activity, but the balance between opposing activities of 11b-HSD1 and 11b-HSD type 2, and changes in A ring reductases. In addition, urinary ratios are not able to determine tissue-specific changes in 11b-HSD1, as has been recently observed in human obesity. A variety of hormonal and nutritional factors regulate 11b-HSD1 expression. In addition, common non-coding single nucleotide polymorphisms (SNP) in HSD11B1 exist, allowing investigation of the genetic contribution to inter-individual variation in cortisol regeneration. SNPs in the 5’ flanking region (rs846910, A to G, ‘SNP 1’) and in an enhancer region in intron 3 (rs12086634, G to T, ‘SNP5’) have been associated independently with insulin resistance, type 2 diabetes and/or hypertension, but not with obesity in several, but not all, populations. Conversely, the G allele of SNP5, which causes lower 11b-HSD1 expression in vitro, is associated with hyperandrogenism amongst lean women with PCOS, although it is not more common amongst PCOS cases as a whole. PCOS is characterized by a high prevalence of all features of the Metabolic Syndrome, but the role played by HSD11B1, although attractive, is unknown. In addition, the consequences of the nonexonic polymorphisms for 11b-HSD1 expression and function in vitro (with the exception of SNP5) or in vivo have not been determined. In subcutaneous adipose tissue biopsies, SNP5 G allele was associated with low 11b-HSD1 mRNA in one patient, but neither SNP1 nor SNP5 genotype predicted 11b-HSD1 mRNA in adipocytes in 61 subjects from a native N American cohort. Urinary ratios of cortisol:cortisone metabolites are not associated with SNP5 genotype. In the present study we aimed to establish the consequences of SNP1 and SNP5 polymorphisms on features of Metabolic Syndrome and of PCOS, and further to define their influence on whole-body and liver or adipose tissue 11b-HSD1 activities. We genotyped a cohort of 600 women in whom metabolic and endocrine variables were carefully assessed, half of whom have PCOS, and selected 40 participants for a nested study in which we undertook detailed measurements of 11b-HSD1 activity in vivo. Whole-body 11b-HSD1 activity was assessed by measuring rate of appearance of 9,12,12-2H3- cortisol (d3-cortisol) during 9,11,12,12-2H4-cortisol infusion. Hepatic 11b-HSD1 activity was quantified by measuring the generation of plasma cortisol following an oral dose of cortisone 25mg after overnight dexamethasone suppression, whereas subcutaneous adipose 11b-HSD1 activity was assessed, in vitro, by measuring the conversion of 1,2,6,7-3H-cortisol to cortisone. In the same homogenates, obtained by sc abdominal fat biopsy, 11b-HSD1 mRNA was quantified. In the whole cohort, allele frequencies were 4% for SNP1 A and 15% for SNP5 G. No participants were homozygous for SNP1 A. There were no differences in the frequency of either SNP, or of haplotypes of both SNPs, between PCOS cases and controls. Very few participants had haplotypes GAGG (n=1) or GGGG (n=11) so they were not included in further analyses. Strikingly, neither SNP had independent effects on phenotype. However, there were differences between individuals of different haplotype. Individuals heterozygous for SNP1 A and homozygous for SNP5 T (GATT) had the highest waist circumference and, particularly amongst the PCOS group, higher plasma transaminase and triglyceride levels, and higher insulin response to the oral glucose tolerance test, as AUC. The proportion meeting the NCEP-ATPIII criteria for Metabolic Syndrome was also substantially higher in women with GATT haplotype (42.3% versus 18% in the whole cohort). The association between GATT haplotype and the Metabolic Syndrome was also observed by analysing PCOS women and controls separately. There were weaker associations between HSD11B1 genotype and hormonal features. Cortisol metabolites were measured in urine of the entire cohort of 600 women to assess relationships between HSD11B1 haplotypes and in vivo 11b-HSD1 activity. As previously reporter, individual SNPs did not predict urinary (5a-THF + 5b-THF)/5b-THE ratio. However, the GATT haplotype was associated with a higher ratio amongst women with PCOS, suggesting higher conversion of cortisone to cortisol. In the nested study, the group with the GATT haplotype had higher whole body rates of appearance of cortisol, reflecting the combination of adrenal cortisol secretion and net regeneration of cortisol by 11b-HSD1, and d3-cortisol, reflecting exclusively the contribution of 11b-HSD1. Rate of appearance of cortisol and d3-cortisol did not differ between PCOS and controls. Women with the GATT haplotype had higher transcript levels of 11b-HSD1 in subcutaneous adipose tissue only if they also had PCOS. Liver 11b-HSD1, measured as appearance of cortisol on first pass conversion after an oral dose of cortisone, was not significantly different between haplotypes, but was significantly lower in PCOS with respect to controls. Subcutaneous adipose tissue 11b-HSD1 trascript levels were positively and significantly correlated with insulin-resistance state and insulin levels. In conclusion, these data demonstrate that the GATT haplotype of HSD11B1 is associated with the Metabolic Syndrome and with increased whole body activity of 11b-HSD1, which appears to be independent of PCOS status. In addition, the whole-body activity is not altered in PCOS, suggesting that any differences which occur in 11b- HSD1 in one tissue are cancelled out by differences in other tissues. The role of tissue-specific dysregulation of 11b-HSD1 in PCOS must be clarified. However, we can speculate that upregulation of adipose 11b-HSD1 can be a key contributor to metabolic dysfunction in women with PCOS. In addition, in the present study we investigated the effect of two polymorphisms upon expression of 11b-HSD1; SNP1 and rs13306421, a rare polymorphism identified in a Japanese population, situated at -2 with respect to the translation start site (SNP-2). We did not find any effect of SNP1, thus suggesting that this SNP can be in linkage disequilibrium with another, functional, polymorphism. At variance, we found that SNP-2 modulates translation of the enzyme, with the A allele resulting in greater enzyme activity and a higher proportion of full-length enzyme synthesised in vitro. However, whether the SNP-2 is truly a polymorphism or may more properly be called a mutation is an open question. In fact, we did not find the A allele in our population of 300 PCOS patients, nor in the case controls. Furthemore, although the A allele was reported at 5% in the original Japanese population, in a further study, genotyping of a total of 210 individuals in four different populations detected only the G allele, as we did. Thus, further studies are required to confirm whether the A allele is indeed a polymorphism. Nevertheless, our studies show the clear potential to influence levels of active 11b-HSD1.