Analisi dell'espressione del retrovirus "Human T-cell Leukemia Virus" di tipo 2 (HTLV-2) in linee cellulari infettate e in linfociti di pazienti

Durante lo svolgimento del dottorato sono state seguite due diverse linee di ricerca. La prima ha riguardato lo studio della proteina transattivatrice Tax del retrovirus umano HTLV (Human T Cell Leukemia Virus) ed, in particolare, il confronto fra le proteine Tax-1 e Tax-2B, rispettivamente di HTLV-1 e HTLV-2B, e l’analisi delle modificazioni post-traduzionali di Tax-2B. La seconda linea di ricerca ha riguardato lo studio dei livelli di espressione dei diversi trascritti di HTLV-2. Per il primo progetto di ricerca, il lavoro è stato focalizzato sulla proteina Tax in quanto ritenuta responsabile della differente patogenicità dei due virus (Lewis et al., 2002). Allo scopo di evidenziare possibili differenze in grado di spiegare questa diversa patogenicità, sono state confrontate le proteine Tax-1 e Tax-2B, che presentano un’omologia di sequenza aminoacidica del 85% (Feuer e Green, 2005). Si è rivelata particolarmente importante la messa a punto di un sistema di rilevazione delle due proteine, basata sull’inserzione di un tag interno a ciascuna proteina (Flag- 6His, abbreviato come “F”) che non ne interferisce con le proprietà transattivanti e che permetta di identificare le due proteine con un solo anticorpo, il che non risultava ancora possibile. Questo sistema ha permesso di osservare che Tax-2B si trova localizzata sia nel citoplasma che in “nuclear bodies” e che è in grado di indurre la traslocazione della subunità RelA di NF-kB e il suo reclutamento all’interno di queste strutture, come è stato già osservato per Tax-1 (Lamsoul et al., 2005). Questi risultati innovativi sono stati recentemente pubblicati (Turci et al., 2009) E’ stato, inoltre, possibile confrontare la localizzazione intracellulare delle proteine Tax-1 e Tax-2B, argomento ancora largamente dibattuto in letteratura (Chevalier et al., 2005; Meertens et al., 2004a; Semmes et al., 1996; Sheehy et al., 2006; Turci et al., 2006), mettendo in luce il fatto che Tax-2B si ritrova localizzata sia nel citoplasma che nei “nuclear bodies” nella maggior parte delle cellule. Il sistema di rilevazione messo a punto in questo progetto ha permesso, inoltre, di confrontare le capacità transattivanti di Tax-1 e Tax-2B mostrando che presentano una efficienza simile, anche se non identica, nell’attivare l’espressione genica attraverso la via NF-kB. In questo studio, inoltre, sono state osservate per la prima volta le forme ubiquitinate e sumoilate di Tax-2B, già evidenziate per Tax-1 (Lamsoul et al., 2005). La seconda linea di ricerca ha riguardato la messa a punto di un sistema efficace e riproducibile per la rilevazione e la quantificazione dei diversi trascritti del virus HTLV-2. Il genoma di questo virus, costituito da due copie di RNA a singolo filamento di circa 9 Kb, necessita di essere integrato (come DNA provirale) all’interno del genoma della cellula ospite. Le proteine strutturali ed accessorie di questo virus vengono prodotte a partire sia dal mRNA “full length” che da mRNA ottenuti in seguito a singolo o doppio splicing. L’ottenimento di un modello preciso del profilo di espressione virale può fornire informazioni importanti nella comprensione del ruolo funzionale di specifici geni virali nel processo di infezione e di trasformazione cellulare (Feuer e Green, 2005; Kashanchi e Brady, 2005; Nicot et al., 2005; Li et al., 2009). Lo studio è stato, quindi, volto ad evidenziare eventuali differenze di espressione a diversi stadi di infezione del virus e in diversi sistemi cellulari. Per la valutazione dell’espressione virale l’analisi è stata messa a punto l’analisi TaqMan Real-Time RT-PCR in cellule infettate da HTLV-2, che prevede l’amplificazione del cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione dell’RNA totale estratto. Nella prima parte dello studio sono state analizzate tre diverse linee cellulari: le linee T Mo- T e C344 Mo (infettate da HTLV-2A) e la linea B BJAB-Gu (infettata da HTLV-2B). L’analisi è stata inizialmente condotta su cellule in fase esponenziale di crescita ed ha evidenziato livelli diversi di espressione dei trascritti fra le linee T e la linea B, in quanto sono stati ottenuti profili di espressione simili per le due linee cellulari T mentre la linea cellulare B ha mostrato un pattern diverso. Successivamente, è stata analizzata la cinetica di espressione del trascrittoma virale nelle linee BJAB-Gu e C344 Mo. Per sincronizzare l’espressione virale le cellule sono state piastrate ad un decimo della loro concentrazione ottimale, diluendo le cellule in crescita esponenziale con il mezzo di coltura. Campioni di cellule sono stati prelevati ed analizzati a diversi tempi dall’inizio della coltura prendendo in considerazione il tempo di divisione cellulare delle due linee (24 ore per la linea BJAB-Gu e 48 ore per la linea C344 Mo). Questa analisi ha mostrato, per la linea BJABGu, una cinetica di espressione precoce con un ciclo di circa 48 ore per alcuni trascritti (tax/rex e p28,p22/p20-1) ed una più tardiva con un ciclo di circa 96 ore per altri trascritti (gag/pol, env e p28,p22/p20-2). Per la linea C344 Mo, tutti i trascritti analizzati hanno mostrato un picco di espressione nelle prime 24 ore dall’inizio della messa in coltura, seguito da una fase discendente. Alcuni trascritti (tax/rex e p10/p11) hanno mostrato un andamento decrescente fino a 48 ore a cui ha fatto seguito un picco di espressione a 96 ore. Per altri trascritti (gag/pol e p28,p22/p20rex-2) è stato osservato un andamento decrescente fino a 96 ore, un successivo incremento di espressione con un picco a 144 ore ed un ulteriore profilo decrescente. Questa linea cellulare ha mostrato, quindi, un progressivo silenziamento dell’espressione genica dopo 144 ore dalla messa in coltura iniziale delle cellule. Successivamente, è stato condotto un esperimento utilizzando PBMC di un paziente italiano infettato con il sottotipo 2B allo scopo di analizzare la cinetica di riattivazione del virus. I PBMC criopreservati sono stati messi in coltura ed analizzati a 4, 14 e 20 ore. E’ stato osservato un andamento precoce e bifasico per il trascritto tax/rex ed un aumento graduale e tardivo dei trascritti gag/pol e delle proteine accessorie p28,p22/p20-1 e -2. Il trascritto env è stato analizzato, ma non è stato possibile rilevarlo. Questi risultati sono riconducibili al fatto che il trascritto tax/rex è necessario all’inizio del ciclo di infezione per transattivare e regolare la trascrizione virale e cellulare, mentre gli altri trascritti sono necessari successivamente in quanto codificano per proteine strutturali ed accessorie. In conclusione, in questo lavoro si è dimostrato che: le proteine Tax-1 e Tax-2B hanno presentano una efficienza simile, ma non identica, nell’attivare l’espressione genica attraverso la via NF-kB; la proteina Tax-2B è localizzata sia nel citoplasma che nei “nuclear bodies” nella maggior parte delle cellule; la proteina Tax-2B si ritrova in forma ubiquitinata e sumoilata. Sono stati inoltre rilevati e quantificati i diversi trascritti di HTLV-2 ottenendo profili di espressione simili per le linee cellulari T e un pattern diverso per la linea cellulare B. La cinetica di espressione virale ha mostrato un profilo ciclico bifasico nella linea B, un andamento progressivamente decrescente nella linea T e, nei PBMC di paziente infettato, un’espressione precoce per tax/rex seguita da un aumento graduale e tardivo degli altri trascritti. Questi risultati stanno ad indicare che il ciclo infettivo comporta una trascrizione più precoce del trascritto per le proteine regolatorie TaxRex a cui fa seguito quella delle proteine strutturali e accessorie.

The research activity of this doctoral thesis was focused on two different projects. The first one concerned the study of the transactivating proteins Tax of the human retrovirus HTLV (Human T Cell Leukemia Virus), and more in detail by comparing Tax-1 and Tax-2B proteins, of HTLV-1 and HTLV-2B respectively, and analysing post-translational modifications of Tax-2B. The second project was focused on the analysis of the expression levels of the different transcripts of HTLV-2. The first research project was centred on the study of Tax proteins, given their responsibility for. To highlight possible functional differences between Tax-1 and Tax-2B, which are considered responsible for the different pathogenicity of the two viruses (Lewis et al., 2002; Feuer e Green, 2005), a careful comparison was undertaken. To this end, a new detection system for the two proteins, based on the insertion of an internal tag (Flag-6His, named “F”), and preserving the transcriptional activities of both proteins, was developed. This system allowed to demonstrate that Tax-2B is also localized in “nuclear bodies” and that it is able to induce the translocation of the RelA subunit of NF-kB and its recruitment in these structures, as previously observed for Tax-1 (Lamsoul et al., 2005). These innovative results have been recently published (Turci et al., 2009). The intracellular localization of Tax-1 and Tax-2B, which is still a matter of debate (Chevalier et al., 2005; Meertens et al., 2004a; Semmes et al., 1996; Sheehy et al., 2006; Turci et al., 2006), was also compared. The results showed that Tax-2B is more frequently present in the cytoplasm and in “nuclear bodies” as compared to Tax-1. The tagging system devised in this study for Tax-1 and Tax-2B allowed also to compare the transactivating abilities of the two proteins, showing that Tax-1 and Tax-2B share similar, though not identical, capacities to activate gene expression via the NF-kB pathway. In this work, the first time demonstration that Tax-2B is modified by ubiquitination and sumoylation, was also obtained, as has been previously observed for Tax-1 (Lamsoul et al., 2005). The second research line concerned the development of an effective and reproducible system for the detection and quantification of the seven different transcripts of HTLV-2. The genome of this retrovirus is made by two copies of single strand RNA of about 9 Kb that are integrated, as proviral DNA, into the host genome. Several structural and accessory proteins from the full length or the singly or doubly spliced mRNA are produced. Obtaining a precise profile of viral gene expression is considered very useful for understanding the functional role of specific viral genes in the process of viral infection and cellular transformation (Feuer e Green, 2005; Kashanchi e Brady, 2005; Nicot et al., 2005; Li et al., 2009). Therefore, the study was addressed to highlight possible expression differences at different stages of viral infection and in different cellular systems. A TaqMan Real-Time RT-PCR analysis system based on the amplification of cDNA retrotranscripted from total mRNA of HTLV-2 infected cells, was developed. In the first part of the study, three different cell lines were analyzed, namely two T-cell lines, Mo-T e C344 Mo, infected with HTLV-2A and a B-cell line, BJAB-Gu infected with HTLV-2B. The analysis on these cells was performed by sampling them at exponential phase of growth. The data obtained showed notable differences between the two T-cell lines and the B-cell line, since a similar pattern of expression for the two T-cell lines was obtained, whereas the B-cell line presented a different profile. To obtain a more clear-cut information on viral expression patterns, the kinetics of HTLV- 2 transcription in BJAB-Gu and C344 Mo cell lines were analyzed. To synchronize viral expression, the cells were plated at one tenth of optimal growth concentration by ten fold dilution of cells at exponential phase with culture medium. After harvesting cells at different times of division of the two cell lines (24 hours for BJAB-Gu and 48 hours for C344 Mo), the transcripts were analyzed. For BJAB-Gu, an early pattern of expression with a cycle of about 48 hours for tax/rex and p28,p22/p20-1 transcripts followed by a second one at about 96 hours for gag/pol, env and p28,p22/p20-2, was visualized. For C344 Mo, all transcripts showed a peak of expression within the first 24 hours followed by a decrease. Some transcripts (tax/rex and p10/p11) showed a decline up to 48 hours followed by a second peak of expression at 96 hours. For gag/pol and p28,p22/p20rex-2 a decreasing pattern of expression up to 96 hours was observed, with a subsequent peak at 144 hours, followed by a second decline. In conclusion, these cell lines showed a progressive silencing of the gene expression after 144 hours from the initial plating. The experimental work also included the kinetics analysis of expression from PBMCs of an Italian HTLV-2B infected subject. Criopreserved PBMCs were cultured, sampled at 4, 14 and 20 hours and analyzed. For tax/rex transcript, an early and biphasic pattern of expression was observed, while gag/pol and p28,p22/p20-1 and -2 showed a gradual and late profile of expression. Also the env transcript was analyzed, but was below the limit of detection. Altogether these results suggest that the tax/rex transcript is necessary early in infection to transactivate and regulate viral and cellular expression, whereas for other transcripts, which code for structural and accessory proteins, the expression can be delayed. In conclusion, this work has demonstrated that: (i) Tax-1 and Tax-2B shared similar, though not identical, capacity to activate gene expression via NF-kB pathway; (ii) Tax-2B is more frequently present in the cytoplasm and in “nuclear bodies” as compared to Tax-1; (iii) Tax-2B is modified by ubiquitination and sumoylation, It also allowed the identification and quantification of the different HTLV-2 transcripts and showed that the two T-cell lines presented similar patterns of expression, whereas it was different for the B-cell line. The B-cell lines showed a biphasic profile and a progressive decline in the T-cells. In PBMCs obtained from an HTLV-2 infected subject, an early expression of tax/rex was accompanied by a gradual increase of structural transcripts. These results indicate that the infection cycle is based on an earlier transcription of Tax/Rex regulatory proteins followed by that of structural and accessory proteins.