NMR characterisation of cytosolic proteins involved in bile acids trafficking

Gli acidi biliari sono molecole anfipatiche derivate dalla catalisi del colesterolo e rappresentano una delle maggiori componenti della bile. La loro funzione principale consiste nella solubilizzazione dei lipidi durante la digestione attraverso la formazione di micelle, ma recentemente è stato riportato anche il loro ruolo nella segnalazione cellulare e nella tumorigenesi. La circolazione entero-epatica, ovvero il meccanismo di riciclo degli acidi biliari tra ileo e intestino, assicura che queste molecole vengano riutilizzate varie volte. A causa delle loro proprietà membranolitiche, il loro trasporto intracellulare attraverso epatociti ed enterociti deve essere mediato da proteine carrier, che appartengono alla famiglia delle fatty acid-binding protein (FABP). I trasportatori di acidi biliari meglio caratterizzati nel fegato e nell’ileo sono la chicken liver bile acid-binding protein (cL-BABP) e la human ileal bile acid-binding protein (hI-BABP), rispettivamente. Nella prima parte di questo studio è riportata la ricerca di nuove BABP, nel fegato umano e nell’ileo di pollo. Mentre il gene per la BABP ileale è stato trovato immediatamente nel genoma di pollo (cI-BABP), la ricerca bioinformatica della BABP di fegato umana (hLBABP) ha dato risultati negativi. L’analisi è stata quindi spostata verso la dimostrazione che un’altra proteina della stessa famiglia, ma con diversa specificità di legame, ovvero la FABP di fegato (hL-FABP), è in grado di interagire con gli acidi biliari in vitro ed è quindi la più probabile responsabile del loro trasporto all’interno degli epatociti umani. La seconda parte del progetto è concentrata sull’espressione e caratterizzazione NMR della cI-BABP e delle sue proprietà di legame. Diversi approcci sono stati usati per lo studio dell’interazione con gli acidi biliari, che appare essere molto complessa e sorprendentemente diversa da quella riportata per le altre proteine della famiglia. Per esaminare ulteriormente i dettagli strutturali di questa interazione è stato iniziato l’assegnamento delle frequenze di risonanza del complesso tra cI-BABP e GCDA e la struttura tridimensionale sarà presto disponibile. Infine sono riportate l’espressione e la caratterizzazione NMR di una variante della BABP ileale umana.

Bile acids are amphipathic molecules derived from the catalysis of cholesterol and represent one of the principal components of bile. Their main function is the solubilization of lipids during digestion through the formation of micelles, but recently it has been reported that they also have a role in cellular signalling as well as in tumourigenesis. The enterohepatic circulation, i.e. the recycling pathway of bile acids between ileum and liver, ensures these molecules to be reused several times. Because of their membranolytic properties, their intracellular transport through hepatocytes and enterocytes has to be mediated by carrier proteins, which belongs to the fatty acidbinding protein (FABP) family. The most characterised proteins transporting bile acids in the liver and ileum are the chicken liver bile acid-binding protein (cL-BABP) and the human ileal bile acid-binding protein (hI-BABP), respectively. In the first part of this study the search for new BABPs, in human liver and chicken ileum, is reported. While the ileal BABP gene was immediately found in chicken genome (cI-BABP), the bioinformatic search for human liver BABP (hL-BABP) gave negative results. The analysis was then moved to demonstrate that another protein of the same family, but with different binding specificity, namely the liver FABP (hL-FABP), is able to interact with bile acids in vitro, and is most likely responsible for their transport inside human hepatocytes. The second part of the project is focused on the expression and characterisation through NMR of the cI-BABP and its binding features. Several approaches have been used to study the interaction with bile acids, that appeared to be very complex and surprisingly different from what was reported for the other proteins of the family. To further investigate the structural details of this interaction, the assignment of the resonance frequencies of the complex between cI-BABP and GCDA has been started and the threedimensional structure will be soon available. Finally the expression and NMR characterisation of a variant of human ileal BABP have been reported.