A genetic approach to study cGMP signaling in plants

In molte specie vegetali, quali per esempio orzo, tabacco ed Arabidopsis thaliana è stata dimostrata la presenza del messaggero secondario 3,5, guanosin-monofosfato ciclico (cGMP). I processi fisiologici in cui è stato dimostrato che questo messaggero gioca un ruolo sono molteplici ed includono lo sviluppo de cloroplasto, lo sviluppo di radici primarie o secondarie, produzione di α-amilasi nel tessuto aleuronico del seme, movimenti stomatici, espressione di geni coinvolti nella difesa e dipendente da ossido nitrico ed infine stress salino/osmotico. Sebbene siano state segnalate alcune proteine con putativa attività guanilato ciclasica in Arabidopsis thaliana, al momento non è ancora stata identificata una guanilato ciclasi regolata da ossido nitrico in pianta. Pertanto non è al momento possibile manipolare i livelli di cGMP mediante un approccio genetico e lo studio di questo messaggero si è principalmente basato su approcci farmacologici. In questo lavoro abbiamo sviluppato un nuovo approccio per lo studio dei segnali mediati da cGMP esprimendo una guanilato ciclasi di mammifero in pianta. Si sono sviluppate a questo scopo piante transgeniche di Arabidopsis thaliana che esprimono in maniera costitutiva una guanilato ciclasi solubile funzionale di mammifero (sub-unità alfa e beta). L’espressione di entrambe le sub-unità dell’enzima è stata confermata mediante analisi di Real-time PCR. Questa piante mostrano una elevata attività guanilato ciclasica ed accumulano quantitativi di cGMP superiori rispetto alle piante wild-type. Due linee transgeniche sono state selezionate per successive studi: una delle due linee in gradi di accumulare 40-50 volte più cGMP e l’altra in grado di accumulare 3-4 volte cGMP rispetto alle piante non trasformate. A livello fenotipico entrambe le piante transgeniche hanno radici più corte delle piante wild type e sono maggiormente sensibili allo stress salino. Inoltre la linea con maggior contenuto in cGMP si è dimostrata essere resistente sia al ceppo virulento che virulento di Pseudomonas syringe. Abbiamo studiato poi i cambiamenti a livello trascittomico indotti dal cGMP mediante la tecnologia microarray nella linea che mostrava il maggior contenuto di cGMP. Si è dimostrato che il cGMP è in grado di modulare l’espressione di 227 geni. I geni modulati ricadono in diversi processi fisiologici quali trasporto, metabolismo, risposta a stress biotico/abiotico, trascrizione e risposta a stimoli ormonali. Queste piante rappresentano un tool molto promettente per lo studio del ruolo del cGMP nella trasduzione del segnale in pianta

The occurrence of the second messenger 3,5-cyclic guanyl monophosphate (cGMP) has been shown in a number of plant species, including barley, tobacco and Arabidopsis. Physiological processes where cGMP signaling has been observed or inferred to play a role include chloroplast development, primary and lateral root growth, α-amylase production in aleurone tissue, stomatal movements, NO-dependent expression of defence-related genes and salt/osmotic stress. Although there have been few reports about putative guanylate cyclases in Arabidopsis thaliana but still to date a genuine NO dependent guanylate cyclase has not been identified in plants. For this reason cGMP levels could not be manipulated by genetical tools and it has been studied by pharmacological approach. In this work we have developed a novel approach for studying cGMP signaling by expressing mammalian soluble guanylate cyclase in plants. Transgenic Arabidopsis thaliana plants have been developed which constitutively express a functional soluble guanylate cyclase (alpha and beta subunits). The expression of both sub-units of the enzyme was confirmed by Real-time PCR. These plants show a considerably higher guanylate cyclase activity and accumulate many folds higher cGMP content as compared to wild type plants. Two lines were selected for further studies; one of the lines accumulating 40-50 fold more cGMP while the other line having 3-4 fold more cGMP than wild type plants. At phenotypic level, both transgenic plants have shorter roots than wild type plants and exhibit a salt stress sensitive phenotype. Further more the line with higher cGMP level was resistant to both virulent and avirulent strains of Pseudomonas syringe. By micrarray technology, cGMP mediated transcriptomic changes were studied in the line with higher cGMP level. cGMP was able to modulate the transcription of 227 genes. The modulated genes belong to diverse physiological processes like transport, metabolism, biotic/ abiotic stress response, transcription and hormone stimulus response. These plants are a powerful tool to study the role of cGMP siganling in plants.