Analisi cinetiche, spettrofotometriche e mutazionali di due enzimi PLP-dipendenti del fold type I. Meccanismi catalitici, processi di folding e dimerizzazione

I risultati discussi in questa tesi di dottorato riguardano lo studio delle relazioni struttura-funzione di due enzimi dipendenti dal piridossal 5’-fosfato appartenenti al fold type I: 1) la cistalisina da Treponema denticola e 2) l’alanina:gliossilato aminotransferasi epatica umana. 1)La cistalisina, un importante fattore di virulenza prodotto dal patogeno orale Treponema denticola, è un enzima omodimerico dipendende dal piridossal 5’-fosfato (PLP) che catalizza la reazione di α,β-eliminazione dell’L-cisteina producendo piruvato, ammoniaca e H2S. La tossicità della cistalisina è stata correlata alla produzione di acido sulfidrico, un composto che ad elevate concentrazioni risulta tossico per molti tipi di cellule. Nel corso di studi precedenti condotti dal mio gruppo di ricerca sono state osservate notevoli differenze nelle caratteristiche dicroiche nella regione del vicino UV e nell’esposizione di superficie idrofobica fra le forme apo e oloenzimatica della cistalisina. Tali differenze suggeriscono che il legame del PLP all’apocistalisina induce un cambiamento conformazionale. Sulla base di questa ipotesi lo scopo di questa ricerca è stato approfondire l’effetto del legame del PLP sulle caratteristiche strutturali delle molecola e chiarire il ruolo del PLP nei processi di folding e dimerizzazione delle cistalisina. Lo studio comparativo di diverse caratteristiche chimico-fisiche di apo e olocistalisina ha rivelato (i) una diversa reattività dei residui di cisteina al DTNB, (ii) un diverso valore del punto isoelettrico e (iii) una diversa suscettibilità alla digestione con proteinasi K delle due forme. L’insieme delle differenze osservate suggerisce che apo e olocistalisina rappresentano due diversi stati conformazionali della stessa molecola. E’ stato condotto inoltre lo studio dei processi di “unfolding” all’equilibrio in urea di apo e olocistalisina mediante l’impiego di molteplici tecniche biofisiche e procedure di analisi. Dal confronto dei profili di “unfolding” risulta che mentre l’apocistalisina è indotta a dissociare in subunità a basse concentrazioni di denaturante e senza perdita significativa di struttura secondaria e terziaria, l’olocistalisina monomerizza solo ad elevate concentrazioni di denaturante quando la struttura della molecola risulta fortemente compromessa. Inoltre, gli studi di “refolding” uniti allo studio dell’equilibrio di dissociazione monomero-dimero di apo e olocistalisina, hanno dimostrato che sia la concentrazione proteica che la presenza o l’assenza di PLP nella miscela di “refolding” influenzano il processo di dimerizzazione e la formazione di aggregati insolubili durante il “folding” della cistalisina. Al fine di studiare l’effetto del PLP nel processo di dimerizzazione della cistalisina è stato condotto uno studio bioinformatico per identificare i residui di interfaccia potenzialmente critici nell’interazione delle subunità nel dimero di cistalisina. Sono stati quindi mutati due residui di interfaccia (Leu57 e Leu62) e un residuo del sito attivo (Tyr64*) che contribuisce all’interfaccia formando un ponte idrogeno con il cofattore della subunità adiacente. Sono stati quindi costruiti, espressi e purificati i mutanti L57A, L62A, Y64*A, L57A/L62A, L57A/Y64*A e L57A/L62A/Y64*A, e l’impatto di ciascuna mutazione sulla struttura dimerica della cistalisina è stato analizzato mediante cromatografia ad esclusione molecolare. I risultati hanno chiarito il ruolo dei residui Leu57, Leu62 e Tyr64* nel processo di dimerizzazione di olo e apocistalisina e hanno dimostrato che la combinazione di due o tre mutazioni genera delle specie enzimatiche che mantengono una struttura monomerica “folded” sia in forma apo che oloenzomatica fino ad elevate concentrazioni proteiche. In particolare, il triplo mutante L57A/L62A/Y64*A mantiene prevalentemente la forma monomerica fino a concentrazioni enzimatiche superiori a 50 μM e dai dati cinetici non risulta in grado di catalizzare le reazioni di α,β-eliminazione, racemizzazione di L- e D-alanina, e semitransaminazione della D-alanina, ma catalizza la semitransaminazione della L-alanina con una velocità superiore a quella misurata per l’enzima wild-type. Le basi strutturali delle caratteristiche cinetiche di tale specie monomerica sono state analizzate e discusse. 2)L’alanina:gliossilato amonotransferasi umana (AGT) è un enzima epatico perossisomiale dipendente dal piridossal 5’-fosfato cha catalizza la transaminazione di alanina e gliossilato in glicina e piruvato. Un deficit di attività dell’AGT è la causa primaria dell’iperossaluria di tipo 1, un raro disordine metabolico a trasmissione autosomico-recessiva. Al fine di ottenere evidenze sperimentali a conferma del ruolo fisiologico dell’AGT, sono stati determinati: i paramentri cinetici dell’enzima allo stato stazionario, la costante di equilibrio (Keq) della reazione globale di transaminazione catalizzata dall’AGT e i parametri cinetici alla stato pre-stazionario relativi alle semireazioni della forma a PLP dell’AGT in presenza di L-alanina o glicina, e della forma a PMP (piridossammina 5’-fosfato) in presenza di gliossilato o piruvato. I risultati indicano che l’AGT è altamente specifica per la reazione di conversione del gliossilato in glicina e confermano l’ipotesi che l’enzima sia fisiologicamente deputato alla detossificazione del gliossilato nei perossisomi. Lo studio del percorso di reazione ha rivelato che la PMP rimane saldamente legata all’enzima durante il ciclo catalitico e che il complesso AGT-PMP presenta una reattività nei confronti dei chetoacidi maggiore di quella misurata per la miscela apoAGT + PMP. Queste osservazioni sono state inoltre correlate ad un possibile riarrangiamento del sito attivo rivelato dallo studio delle caratteristiche dicroiche degli intermedi catalitici. Sono state inoltre analizzate le caratteristiche spettroscopiche e cinetiche del mutante patogenico G82E. Analogamente all’enzima wild-type il mutante G82E risulta in grado di legare 2 moli di PLP/dimero ma presenta minore affinità per il PLP ed una ancora minore affinità per la PMP rispetto all’AGT wild-type. I risultati cinetici suggeriscono che il maggiore difetto molecolare del mutante G82E consiste nella drammatica diminuzione della velocità di catalisi della reazione complessiva di transaminazione (0,1% del wild-type) che dipende sia dalla bassa efficienza di transaldiminazione che dalla bassa efficienza di conversione della forma AGT-PLP nella forma AGT-PMP del mutante G82E.

The results described in this thesis concern the structure-functional relationships of two PLPdependent enzyme belonging to the fold-type I family: 1) Treponema denticola cystalysin and 2) human alanine:glyoxylate amonotransferase (AGT). 1) Cystalysin, a key virulence factor of the human oral pathogen Treponema denticola responsible for periodontis, is a homodimeric pyridoxal 5’-phosphate (PLP)-dependent enzyme, which catalyzes the α,β-elimination of L-cysteine producing pyruvate, ammonia, and H2S. Cystalysin toxicity has been related to the production of H2S, a compound that is toxic to most cells at high concentrations. Previews investigations carried out by my research group provided evidence for remarkable difference in the near-UV CD spectra of holo and apo-cystalysin, and in their ability to enhance ANS emission fluorescence and intensity. In order to gain further insights on this issue, in this study the role of PLP cofactor in the structural features, and in both folding and dimerization processes of the enzyme has been investigated. Several indicators have been used as probes of the different conformational status of T. denticola cystalysin in the holo and apo form. Compared to holoenzyme, the apoenzyme displays an altered reactivity of cysteine residues, a significantly different pI, and a differential susceptibility to proteinase K. These findings confirmed that apo and holocystalysin represent two distinct conformational states of the enzyme. In addiction, the urea-induced folding equilibrium of holo and apocystalysin has been studies by a variety of biophysical techniques and analytical procedures. Urea-induced unfolding profiles show that monomerization of apocystalysin occurs at low denaturant concentration without the significant loss of secondary and tertiary structures, whereas it takes place for holocystalysin at high denaturant concentration, once the structure is sufficiently destabilized. Moreover, refolding studies, together with analysis of the dissociation/association process of cystalysin, shed light on how the protein concentration and the presence or absence of PLP under refolding conditions could affect the dimerization of the enzyme and the production of insoluble aggregates. In order to clarify the role of the cofactor in the dimerization process, two interfacial residues (Leu57 and Leu62) and an active site residue (Tyr64*), hydrogen-bonded with the PLP phosphate group of the neighboring subunit, have been mutated on the base of preliminary bioinformatic analysis. The wild-type and the L57A, L62A, Y64*A, L57A/L62A, L57A/Y64*A, L57A/L62A/Y64*A mutants have been constructed, expressed, and purified. The impact of these mutations on the dimeric state of cystalysin in the apo- and holo-form has been analyzed by sizeexclusion chromatography. The results shed light on the role of Leu57, Leu62 and Tyr64 in the dimerization process of holo and apoenzyme, and demonstrate that combination of two or three mutations leads to species which remain in a folded monomeric state at a reasonably high concentration in both the apo- and holo-forms. In particular L57A/L62A/Y64*A remains prevalently monomer at a concentration up to 50 μM. Kinetic analyses show that, in monomeric triple mutant, the α,β-eliminase, alanine racemase, and D-alanine half-transaminase activities are almost abolished, while the L-alanine half-transaminase activity is slightly enhanced when compared with that of wild-type cystalysin. The structural basis of the stereospecific transaminase activity displayed by the engineered folded PLP-bound monomer has been analyzed and discussed. 2) Human hepatic peroxisomal AGT (alanine:glyoxylate aminotransferase) is a PLP (pyridoxal 5’- phosphate)-dependent enzyme whose deficiency causes primary hyperoxaluria type I, a rare autosomal recessive disorder. To acquire experimental evidence for the physiological function of AGT, the Keq,overall of the reaction, the steady-state kinetic parameters of the forward and reverse reactions, and the pre-steady-state kinetics of the half-reactions of the PLP form of AGT with Lalanine or glycine and the PMP (pyridoxamine 5’-phosphate) form with pyruvate or glyoxylate have been measured. The results indicate that the enzyme is highly specific for catalysing glyoxylate to glycine processing, thereby playing a key role in glyoxylate detoxification. Analysis of the reaction course also reveals that PMP remains bound to the enzyme during the catalytic cycle and that the AGT–PMP complex displays a reactivity towards oxo acids higher than that of apoAGT in the presence of PMP. These findings are tentatively related to possible subtle rearrangements at the active site also indicated by the putative binding mode of catalytic intermediates. Additionally, the catalytic and spectroscopic features of the naturally occurring G82E variant have been analysed. Although, like the wild-type, the G82E variant is able to bind 2 mol PLP/dimer, it exhibits a significant reduced affinity for PLP and even more for PMP compared with wild-type, and an altered conformational state of the bound PLP. The striking molecular defect of the mutant, consisting in the dramatic decrease of the overall catalytic activity (0.1% of that of normal AGT), appears to be related to the inability to undergo an efficient transaldimination of the PLP form of the enzyme with amino acids as well as an efficient conversion of AGT–PMP into AGT–PLP. Overall, careful biochemical analyses have allowed elucidation of the mechanism of action of AGT and the way in which the disease causing G82E mutation affects it