Regolazione del colore della bacca di vitis vinifera: identificazione ed analisi funzionale di fattori di trascrizione MYB e bHLH

Gli antociani (dal greco “ἀνθός ( anthos) = fiore, κυανός (kyáneos )= blu) o antocianine sono una classe di pigmenti idrosolubili appartenente alla famiglia dei flavonoidi. Il colore delle antocianine può variare dal rosso al blu e dipende dal pH del mezzo in cui si trovano e dalla formazione di sali con metalli pesanti presenti nei vari tessuti. Il colore della bacca di Vitis vinifera è determinato dall’accumulo di antociani nel vacuolo delle cellule dell’epidermide durante la maturazione. Delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina e malvidina sono i principali pigmenti isolati da bacche di Vitis vinifera (Garcia-Beneytez et al, 2002), trovati principalmente come 3-O-glucosidi, e in porzione minore, come esteri di acidi acetico, caffeico e p-cumarico. La composizione in pigmenti, essendo cultivar specifica, risulta essere un marcatore biochimico importante per identificare le diverse varietà di Vitis vinifera, anche se la loro biosintesi varia durante la maturazione e dipende da fattori ambientali (Garcia-Beneytez et al., 2002). Dal momento che lo spettro di assorbimento degli antociani dipende dal pH, la colorazione della buccia dovrebbe essere anch’essa influenzata dai livelli di pH vacuolare delle cellule di questo tessuto. Gli aspetti genetici e biochimici del pathway biosintetico degli antociani, e il loro ruolo nella pigmentazione degli organi sono stati ben caratterizzati in Zea mais, Petunia hybrida, Antirrhinum major ed Arabidopsis thaliana. Riuscire a caratterizzare tale fenomeno anche nelle specie da frutto commercialmente importanti quali ad esempio Vitis vinifera, avrebbe un grande impatto applicativo. Numerosi studi hanno recentemente dimostrato che il pathway della biosintesi degli antociani è regolato da proteine MYB, bHLH e WD40 simili tra le varie specie, indicando che la funzione di questo complesso proteico è assai conservata nel mondo vegetale. In particolare, in Petunia hybrida è stato proposto un modello che spiega la presenza di elementi regolatori comuni tra il pathway per la biosintesi degli antociani e il pathway per la regolazione del pH vacuolare (Quattrocchio et al., 2006). In questo sistema il gene PhAN1, codificante per un fattore di trascrizione di tipo bHLH, regola la sintesi degli antociani attraverso l’interazione con una proteina MYB codificata dal gene PhAN2, mentre regola l’acidificazione vacuolare interagendo con un’altra proteina MYB codificata dal gene PhPH4. In questo modello sono coinvolte anche una proteina appartenente alla famiglia WD40, PhAN11 e un altro membro della famiglia bHLH, PhJAF13. Attraverso l’analisi del genoma di Vitis vinifera recentemente decodificato (French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, Nature 2007; Velasco et al. 2007), è stato possibile isolare ed analizzare le sequenze dei geni codificanti i fattori di trascrizione appartenenti alle famiglie di proteine MYB, bHLH e WD40. Le conoscenze del meccanismo regolativo di Petunia hybrida possono essere il punto di partenza per la comprensione del controllo del colore e del pH vacuolare della bacca di Vitis vinifera durante lo sviluppo. Analisi filogenetiche (Quattrocchio et al., 2006) hanno evidenziato un buon livello di omologia di sequenza della proteina PhPH4 di Petunia hybrida con due proteine MYB di Vitis vinifera, VvMYB5a (noto in letteratura anche come VvMYBCS1) e VvMYB5b. Simili analisi hanno permesso di evidenziare la presenza di tre proteine di Vitis vinifera, VvMYBA1, VvMYBA2 e VvMYBA3 (Kobayashi et al., 2002, 2004; Walker et al., 2007), che presentano una buona omologia di sequenza con PhAN2 (Quattrocchio et al., 2006). Inizialmente questo lavoro prevede un’analisi biochimica di caratterizzazione delle variazioni dei livelli di pH vacuolare in buccia, in polpa ed in bacca intera di Vitis vinifera cv. Corvina in diversi stadi di sviluppo a partire da 14 giorni dopo la fioritura fino a maturazione (circa 120 giorni dopo la fioritura), con intervalli di una settimana. Dal punto di vista genetico-molecolare invece si parte dal presupposto che, molto spesso, la funzione di una proteina dipende in gran parte dalla sua sequenza amminoacidica, e quindi dalla sequenza nucleotidica del gene che la codifica, sebbene essa possa poi essere soggetta a vari tipi di regolazione post-traduzionale. Quindi, partendo da tale ipotesi, in questo lavoro vengono isolate le sequenze nucleotidiche di Vitis vinifera cv. Corvina caratterizzate da una maggior omologia con i geni MYB, bHLH e WD40 di Petunia hybrida coinvolti del complesso trascrizionale che regola la biosintesi degli antociani e l’acidificazione del pH vacuolare. Data la notevole difficoltà tecnica di attuare esperimenti di genomica funzionale in Vitis vinifera, è molto utile l’utilizzo di mutanti per singoli geni di fattori di trascrizione MYB, e bHLH di Petunia hybrida, in cui esprimere il rispettivo omologo di vite. Quindi per dimostrare se omologhi di sequenza sono anche omologhi funzionali si utilizzano piante di Petunia hybrida mutanti per ogni singolo gene in esame ed in esse viene espresso ectopicamente il rispettivo omologo di sequenza di Vitis vinifera. La dimostrazione che l’omologia di sequenza tra questi geni corrisponde anche ad un’omologia funzionale, si avrà se il gene di Vitis vinifera sarà in grado di ripristinare la funzione mancante del mutante di Petunia hybrida. Inoltre, oltre all’analisi funzionale, risulta di estremo interesse studiare i profili di espressione dei geni di Vitis vinifera isolati nella bacca durante lo sviluppo attraverso analisi di RT Real Time PCR. Infine per poter affermare se il modello proposto per Petunia hybrida può essere valido anche per Vitis vinifera è necessario studiare eventuali interazioni proteina-proteina tra i potenziali fattori di trascrizione studiati. Per tale dimostrazione viene utilizzata l’analisi BiFC (Bimolecular Fluorescence complementation, Walter et. Al 2004).

Anthocyanins (from Greek: “ἀνθός ( anthos) = flower + κυανός (kyanos) = blue) are a class of water-soluble pigments belonging to the flavonoids family. The colour of anthocyanins can vary from red to blue and it depends on medium pH in which they are located and on the formation of salts with heavy metals present in various tissues. In Vitis vinifera the berry colour is determined by the accumulation of anthocyanins in vacuole cells during development. Delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin and malvidin are the most important pigments isolated from the Vitis vinifera berries (Beneytez-Garcia et al, 2002); they can be found mainly as 3-O-glucosides, and in smaller portion, such as acetic acid, caffeic acid and p-coumaric acid esters. The pigments composition is cultivar specific and it is an important biochemical marker to identify different Vitis vinifera varieties although anthocyanins biosynthesis depends on development stages and on environmental factors (Garcia-Beneytez et al., 2002). The absorption spectrum of anthocyanins depends on the pH, so the colour of the skin should also be influenced by pH levels of vacuolar cells of the tissue. Genetic and biochemical aspects of anthocyanins biosynthesis pathway and their role in the pigmentation of the tissues have been well characterized in Zea mais, Petunia hybrida, Antirrhinum major and Arabidopsis thaliana. The characterization of this phenomenon even in commercially important fruit species such as Vitis vinifera, would have a big impact application. Several studies have recently shown that anthocyanins biosynthesis pathway is regulated by MYB protein, bHLH and WD40 similar among different species, indicating that the function of this complex is highly conserved in plant proteins. In particular, in Petunia hybrida it was proposed a model that explains the presence of common elements between anthocyanins biosynthesis regulatory pathway and the vacuolar pH regulation pathway (Quattrocchio et al., 2006). In this system the PhAN1 gene, coding for a bHLH type transcription factor, regulates the anthocyanins synthesis through interaction with a MYB protein encoded by the PhAN2 gene, while vacuolar acidification is regulated by interaction with another MYB protein encoded by PhPH4 gene. In this model are also involved PhAN11, a protein belonging to the WD40 family, and PhJAF13, another bHLH family member . By Vitis vinifera genome analysis (French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, Nature 2007; Velasco et al.2007), it was possible to isolate and analyze genes sequences coding for transcription factors belonging to MYB, bHLH and WD40 protein families. The knowledge of regulative mechanism of Petunia hybrida could be the starting point to understand the control of berry colour and berry vacuolar pH during development. Phylogenetic analysis (Quattrocchio et al., 2006) have shown a high degree of sequence homology between the Petunia hybrida PhPH4 protein and two Vitis vinifera MYB proteins VvMYB5a (known in the literature also as VvMYBCS1) and VvMYB5b. Similar analysis have revealed the presence of three Vitis vinifera proteins, VvMYBA1, VvMYBA2 and VvMYBA3 (Kobayashi et al., 2002, 2004, Walker et al., 2007), showing a good sequence homology with PhAN2 (Quattrocchio et al., 2006). Initially, this work provides a biochemical characterization of vacuolar pH variations in skin, in flesh and whole berry of Vitis vinifera cv. Corvina in various developmental stages from 14 days after anthesis to ripening (approximately 120 days after anthesis), weekly sampled. Frequently, the function of a protein depends on its amino acid sequence, and so on nucleotide sequence of the encoding gene, although it may then be modified by some posttranslation regulations. Then, on the basis of this assumption, in this work have been isolated the Vitis vinifera cv. Corvina nucleotide sequences characterized by a greater homology with Petunia hybrida MYB, bHLH and WD40 genes involved in the transcriptional complex that regulates the anthocyanins biosynthesis and vacuolar pH acidification. Vitis vinifera functional genomics are very difficult because it is not simple to transform the grape so is very useful to use Petunia hybrida like model system. Petunia mutants for each MYB and bHLH transcription factors genes are available to express their homologue of grape gene. So, to prove whether homologous sequence are also functional homologous, we expressed ectopically in Petunia hybrida plants mutants for each gene their Vitis vinifera homologous sequence. The demonstration that the sequence homology between these genes corresponds also to an effective functional homology, can be achieved by the restore of missing function of the Petunia hybrida mutant by Vitis vinifera gene. Moreover it is very interesting to study the expression profiles of genes isolated in Vitis vinifera berry during fruit development by RT Real Time PCR analysis. Finally, to demonstrate whether the Petunia hybrida model may be valid also for Vitis vinifera it is necessary to study some protein-protein interactions between potential transcription factors we studied. For this demonstration we use BiFC analysis (Bimolecular Fluorescence Complementation, Walter et. At 2004).