Identification of a candidate alternative promoter region of human BCL2L11 (BIM) - Characterization of pancreatic cancer stem cells

Abstract I part: “Identification of a candidate alternative promoter region of Human BCL2L11 (BIM)”. Introduzione: Benchè il ruolo della proteina BCL2L11 (BIM) nei vari processi apoptotici sia stato dimostrato nella biologia dello sviluppo e nella malattia, in realtà si conosce poco della struttura del promotore del locus umano del gene BCL2L11 e degli elementi cis che regolano la sua espressione nel gene umano. Risultati: Durante la ricerca di nuove sequenze promotrici del locus umano di BCL2L11 abbiamo identificato sequenze genomiche, precedentemente non identificate, che mostrano attività di promotore e responsività al fattore di trascrizione E2F e che, regolano l’espressione di trascritti codificanti di BCL2L11. Nell’uomo, i trascritti che originano da questo nuovo promotore putativo contribuiscono significativamente all’espressione dell’ mRNA di BCL2L11 nel testicolo, nel cuore e nel fegato. L’attività di tale ipotetico nuovo promotore, testata nelle HEK293, origina trascritti appartenenti al gene BCL2L11, la cui espressione può essere modulata da Tricostatina A, noto modulatore dell’attività di BCL2L11,e da E2F, fattore di trascrizione già studiato come regolatore trascrizionale di BCL2L11. Conclusioni: L’identificazione del nuovo promotore del gene umano di BCL2L11 fornisce nuove delucidazioni sulla struttura e nella regolazione del locus di BCL2L11. Abstract II part “Characterization of pancreatic cancer stem cells” Presupposti e scopo: Nonostante gli enormi sforzi della ricerca sul carcinoma del pancreas, tutt’oggi questo tumore aggressivo rimane incurabile. Recenti studi hanno posto l’attenzione sull’esistenza di cellule staminali neoplastiche. Lo scopo della nostra ricerca è stato quello di caratterizzare il profilo d’espressione e il potenziale comportamento di tipo staminale tumorale delle cellule di cancro del pancreas Panc-1 cresciute come sfere tridimensionali. Le sfere pancreatiche sono state generate aggiungendo ben noti fattori di crescita. Lo scopo del presente studio è stato quello di collegare le caratteristiche di aggressività delle sfere tumorali con quelle di staminalità. Risultati: . Per dimostrare l’ipotesi che le cellule neoplastiche capaci di crescere in sfere hanno proprietà di tipo staminale che mancano alle cellule che crescono aderenti al substrato, l’espressione dei marcatori di staminalità descritti per il pancreas (CD24, CD44, ESA) è stata valutata sia nelle PANC1 sfere che nelle aderenti a livello genico e proteico usando tecniche di qRT-PCR e di analisi al FACS. L’ elevata espressione dei marcatori di metastasi e invasione CXCR4, Ostepontina (fino a 300 volte) e i componenti della pathway di Sonic Hedeghog supportano l‘ipotesi che le cellule capaci di crescere in sfere possiedono una aggressività maggiore. Il diverso comportamento delle sfere rispetto alle cellule aderenti è stato confermato utilizzando sia in vitro utilizzando un panello di saggi fenotipici che in vivo mediante modelli di xenotrapianto in topo immunodeficiente . Conclusioni: Abbiamo identificato e validato un nuovo modello cellulare che meglio rappresenta la situazione clinica reale, tale modello si prospetta utile per futuri studi di potenziali candidati farmaci sia in vitro che in vivo.

Abstract I part “Identification of a candidate alternative promoter region of Human BCL2L11 (BIM)”. Background: Despite the importance of the BCL2L11 (BIM) protein in various apoptotic processes in development and disease, little is known of the promoter structure of the human BCL2L11 locus and of the cis-acting elements regulating expression of the human gene. Results: In the search for novel promoter sequences in the human BCL2L11 locus, we have identified previously unrecognized genomic sequences displaying promoter activity and E2F responsiveness, and driving the expression of BCL2L11 coding transcripts. In man, transcripts originating from this novel putative promoter contribute significantly to total BCL2L11 mRNA expression in testis, heart and liver. In HEK293 cells, this novel candidate promoter originates BCL2L11 transcripts whose expression can be modulated by a known modulator of BCL2L11 expression (Trichostatin A) and by E2F, a characterized transcriptional regulator of BCL2L11 expression. Conclusion: The identification of a novel putative human BCL2L11 promoter provides new insights into the structure and regulation of the BCL2L11 locus. Abstract II part “Characterization of pancreatic cancer stem cells” Background: Pancreatic cancer remains a highly aggressive and not curable cancer in spite of the ample research in the last decades. Recent studies have suggested the existence of neoplastic stem cells that sustain the growth of cancer. The aim of the present thesis was to characterize the expression profiles and potential stem-like behavior of Panc-1 cells grown as 3- dimensional spheres. The pancreatic spheres were generated by the addition of well-defined growth factors. The aim of the current study was to link aggressiveness to stemness in sphere growing pancreatic tumour cells. Results: To test the hypothesis that cancer cells growing as spheres demonstrate stem-like properties whereas the cancer cells that grows adhering to the substrate do not, the expression of the reported pancreatic stem cell markers (CD24, CD44 and ESA) has been assessed in PANC1 spheres and adherent cells at the gene and protein level using qRT-PCR and FACS analysis. The higher expression of the metastasis and invasion markers CXCR4, Osteopontin (up to 300 fold), and Sonic Hedgehog pathway elements in the spheres supports the concept that cancer cells able to grow in spheres allegedly possess an increased aggressivity. The different behaviour of spheres vs. adherent cells has been confirmed using a panel of in vitro phenotypic assays as well as in a xenograft mouse model. Conclusion: We have identified and validated a novel research tool which mimics better the real clinical situation for both in vitro as well as for in vivo further study of potential drug candidates. PDF