Regulation of light harvesting in plants: structural and functional studies of the Violaxanthin De-epoxidase

Gli organismi fotosintetici , come piante ed algae. hanno bisogno dell’energia luminosa per la loro sopravvivenza tuttavia le condizioni ambientali sono estremamente variabili e questi devono riuscire a rispondere a breve e a lungo termine ai diversi stimoli: quando la luce esterna è debole l’assorbimento luminoso deve essere potenziato, mentre in condizioni di alta luminosità, l’energia in eccesso deve essere dissipata, evitando così la formazione di specie radicaliche, dannose per le cellule. I carotenoidi sono molecole con un ruolo chiave nella risposta alle diverse condizioni ambientali, essendo capaci di dissipare le potenziali specie reattive. In aggiunta a ciò, quando l’illuminazione è in eccesso, si attiva la sintesi della zeaxantina, un carotenoide particolarmente efficiente nella foto protezione. Quando la luce ritorna nelle condizioni normali, zeaxantina è riconvertita a violaxantina. Quindi, in relazione alle diverse condizioni di illuminazione, c’e’ una conversione tra le due specie, creando il cosi’ detto ciclo delle xantofille, che è capace di modulare l’efficienza di assorbimento da parte dell’apparato fotosintetico. Gli enzimi coinvolti nel ciclo delle xantofille sono la violaxantina de‐eposidasi (VDE) e la zeaxantina eposidasi (ZE), che catalizzano rispettivamente la sintesi e la degradazione della zeaxantina. Lo scopo di questo lavoro fu quello di capire il meccanismo molecolare della regolazione del ciclo delle xantofille, dallo studio delle proprietà biochimiche e strutturali di questi due enzimi. L’attenzione fu particolarmente rivolta all’enzima VDE, mentre solo un lavoro preliminare fu fatto sulla ZE (appendice 1). Nel caso della VDE, invece, fummo in grado di ottenere i primi dati strutturali sull’enzima, risolvendo la struttura terziaria del dominio lipocalinico della proteina che rappresenta metà della proteina. Grazie a questi dati siamo riusciti a dimostrare come la proteina cambia conformazione in funzione del pH. I dati strutturali raccolti danno inoltre un’idea di quale possa essere il sito di legame dell’enzima, anche identificando i residui coinvolti nella reazione. Infine nel capitolo 3 analizziamo il ruolo delle rimanenti parti dell’enzima nelle loro funzioni: il risultato più evidente consiste nell’aver identificato il dominio C‐terminale, ricco in residui Gluttammici, fondamentale per l’associazione della proteina alle membrane tilacoidali. In appendice 2, invece, è presentato il lavoro preliminare sul licopene β ciclasi, un enzima della biosintesi dei carotenoidi. Abbiamo espresso e purificato la proteina ricombinante per produrre un anticorpo specifico che riconoscesse l’enzima. Quest’ultimo lavoro è parte di un più ampio progetto, rivolto a studiare la regolazione della biosintesi dei carotenoidi nelle piante in risposta alle condizioni ambientali.

Plants are sessile organisms: when environmental conditions change, they cannot move but have to respond by adapting their metabolism. This is particularly challenging with respect to illumination: harvesting efficiency must be maximized when light is limiting while in high light conditions all energy in excess has to be dissipated to avoid the fast formation of radical species harmful for the cell. Carotenoids are molecules with a key role in the response to environmental conditions, being able to safely dissipate potentially reactive excited species. In addition to this general ability of all carotenoids, when illumination is in excess there is the activation of the synthesis of zeaxanthin, a carotenoid particularly efficient in photoprotection. When light is back to normal, zeaxanthin is back converted into violaxanthin. Depending on illumination conditions, thus, there is a conversion between these two species, forming the so called xanthophyll cycle, which are modulating the light harvesting efficiency of photosynthetic apparatus. Enzymes involved in the xanthophyll cycle are the violaxanthin de-epoxidase (VDE) and zeaxanthin Epoxidase (ZE), which are catalyzing respectively the synthesis and degradation of zeaxanthin. The aim of this work was to understand the molecular mechanisms of the regulation of the xanthophyll cycle, by studying the biochemical and structural properties of these two enzymes. The attention was particularly focused on VDE, while only preliminary work was done on ZE (appendix 1). In the case of VDE, instead, we were able to obtain the first structural information on the enzyme, resolving the 3D structure of the lipocalin like domain of the protein, representing half of the full protein. Thanks to these data we were able to show how the protein in undergoing a pH dependent conformational change. Structural data also provided suggestions on the violaxanthin binding site to the enzyme. This hypothesis was tested in the chapter 2 by site directed mutagenesis. Merging structural and mutational data we were able to propose a confident model of violaxanthin binding to the enzyme, also identifying residues involved in the catalytic reaction. Finally in chapter 3 we analyzed the role of the remaining part of the protein for the protein function: major result was the finding that the C terminal domain, rich in Glu residues, is important for the association of the enzyme to the thylakoids membrane. In appendix 2 is instead presented some preliminary work on lycopene β-cyclase, an enzyme of the carotenoid biosynthetic pathway. We expressed and purified the recombinant protein to produce a specific antibody recognizing the enzyme as part of a wider project aiming to study the regulation of carotenoid biosynthesis in plants in response to environmental conditions.