Tyrosyl DNA phosphodiesterase 1 as a putative target for camptothecin-based antitumor treatment

Le camptotecine sono agenti citotossici con un ampio spettro di attività antitumorale e hanno un meccanismo d’azione peculiare poiché inibiscono la DNA topoisomerasi IB (Topo I), un enzima coinvolto nella regolazione di funzioni cellulari fondamentali quali la replicazione del DNA, la trascrizione, la ricombinazione e la riparazione del danno. La Topo I catalizza cambiamenti della topologia del DNA attraverso il taglio transiente e la ricucitura dell’acido nucleico. Tale reazione porta alla formazione di un complesso covalente enzima-DNA, il “cleavable complex” attraverso il gruppo idrossile di una tirosina dell’enzima, legato covalentemente all’estremità 3’ del DNA. Le camptotecine avvelenano la Topo I stabilizzando il complesso DNA-enzima, evento che – in cellule tumorali proliferanti - causa un arresto della replicazione e la formazione di rotture irreversibili nel DNA. Per la natura del complesso DNA-Topo I, la tirosil DNA fosfodiesterasi 1 (TDP1), che catalizza l’idrolisi del legame tra il residuo tirosilico e il gruppo 3’ fosfato è coinvolta nella riparazione dei complessi covalenti Topo I-DNA e rappresenta un potenziale bersaglio di modulazione dell’attività delle camptotecine. Sulla base di queste premesse, lo scopo di questo studio era la definizione del potenziale interesse di TDP1 quale bersaglio nella terapia dei tumori, con particolare riferimento al suo ruolo nella resistenza cellulare a gimatecan, una camptotecina attualmente in sperimentazione clinica. Poiché in linee cellulari di carcinoma ovarico selezionate nel nostro laboratorio per resistenza a gimatecan (IGROV-1CPT/H and IGROV-1CPT/L), la resistenza era associata ad aumentati livelli di TDP1, il significato di questo fattore è stato inizialmente esplorato in tali modelli cellulari. Le varianti resistenti avevano un grado di resistenza a gimatecan di circa 6 e presentavano cross-resistenza ad altre camptotecine (topotecan, SN38) e a inibitori della DNA topoisomerasi II. Inoltre, le cellule resistenti erano caratterizzate da una maggior capacità di riparare le rotture a singolo filamento indotte nel DNA da gimatecan e presentavano una ridotta frequenza di rotture a doppio filamento. Il silenziamento di TDP1 produceva un aumento delle rotture doppie in cellule resistenti trattate con gimatecan, come dimostrato mediante immunofluorescenza con anticorpo anti istone fosfo-H2AX. La linea cellulare di osteosarcoma U2-OS, particolarmente adatta a studi funzionali è stata successivamente impiegata per studiare se TDP1 potesse costituire un bersaglio di modulazione dell’efficacia delle camptotecine. L’inattivazione di TDP1 attraverso trasfezione di “small-interfering RNAs” sintetici o mediante l’espressione stabile di microRNA specifici non produceva un cambiamento della sensibilità cellulare a gimatecan. Tuttavia, l’inattivazione simultanea di altri “pathways” coinvolti con TDP1 nella risposta cellulare agli inibitori di Topo I risultava in una marcata sensibilizzazione a gimatecan e suggeriva una cooperazione tra XRCC1 - una proteina “scaffold” coinvolta nella riparazione delle rotture al DNA - e TDP1 nella risposta a bassi livelli di danno indotti dal farmaco. Inoltre, cellule U2-OS sovra-esprimenti TDP1 presentavano una modesta resistenza a gimatecan, osservata impiegando il test di inibizione della crescita delle colonie. Questo comportamento si associava a una diminuzione dei livelli di rotture a singolo filamento dopo esposizione al farmaco. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che TDP1 abbia un ruolo nell’acquisizione della resistenza cellulare alle camptotecine, come dimostrato dalla sua aumentata espressione in cellule resistenti e come documentato dai ridotti livelli di danno in cellule che sovraesprimono TDP1. Tuttavia, TDP1 di per se sembra non essere in grado di conferire elevati livelli di resistenza, come dimostrato mediante approcci funzionali. Il ruolo della proteina nella riparazione del danno appare pertanto non essenziale. La cooperazione tra TDP1 ed altri “pathways” nella regolazione della sensibilità alle camptotecine è l’evento più probabile, ma rimangono da definire i fattori più critici nella risposta cellulare alle camptotecine ed in particolare a gimatecan. In conclusione, TDP1 per se non sembra essere un bersaglio promettente nell’ambito delle terapie basate sull’impiego di camptotecine. Tuttavia, è prevedibile che l’inibizione di TDP1 in cellule tumorali con difetti in altri “pathways” rilevanti per la riparazione del danno mediato da Topo I possa favorire la morte cellulare dopo esposizione alle camptotecine. Poiché i tumori possono avere difetti nei “checkpoint” cellulari, l’inattivazione simultanea di TDP1 e altri fattori critici potrebbe contribuire a chiarire gli aspetti più rilevanti della riparazione del danno mediato da Topo I.

Camptothecins are cytotoxic agents with a wide spectrum of antitumor activity and are endowed with a unique mechanism of action because they inhibit DNA topoisomerase IB (Topo I), an enzyme implicated in crucial cellular processes such as DNA replication, transcription, recombination and repair. Topo I catalyzes changes in the DNA topology by transiently breaking and resealing the nucleic acid backbone. The enzyme forms a covalent bond at the 3’ terminus of the nicked DNA. Such a reaction leads to the formation of a Topo I covalent complex (i.e cleavable complex) through a tyrosine hydroxyl group of the enzyme. Camptothecins poison Topo I by stabilizing the DNA-Topo I complex, thereby leading - in proliferating tumor cells – to replication fork arrest and generation of irreversible DNA strand breaks. Because of the features of the Topo I-DNA lesions, Tyrosyl DNA phosphodiesterase 1 (TDP1), which catalyses the hydrolysis of 3’ phosphotyrosyl bonds is implicated in repair of Topo I-DNA covalent complexes and represents a putative target for modulating the activity of camptothecins. Thus, the aim of the present study was to define the potential interest of TDP1 as a target in antitumor therapy with particular reference to its role in cellular resistance to gimatecan, a camptothecin currently undergoing clinical evaluation. Since in ovarian carcinoma cell lines selected for resistance to gimatecan (IGROV-1CPT/H and IGROV-1CPT/L), resistance was associated with increased levels of TDP1, the significance of this factor has been initially explored in these ovarian carcinoma cell lines. The selected sublines exhibited around 6-fold resistance to gimatecan, cross-resistance to other camptothecins (topotecan, SN38) and to DNA topoisomerase II inhibitors. The resistant cells displayed an increased capability to repair gimatecan-induced single-strand breaks and a reduced amount of double-strand breaks. TDP1 silencing resulted in an increased amount of gimatecan-induced double-strand breaks, as assessed by staining of phosphorylated H2AX histone in resistant cells. The U2-OS cell line that is very suitable for loss and gain of function studies was then employed to investigate whether TDP1 may be a target for modulating the efficacy of camptothecins. Knocking down of TDP1 either by transfection of synthetic small interfering RNAs or by stable expression of exogenous TDP1 tailored miRNAs did not produce a change in cell sensitivity to gimatecan. However, co-targeting of other pathways cooperating with TDP1 in cell response to Topo I poisons indicated that XRCC1 – a scaffold protein implicated in DNA strand break repair - may cooperate with TDP1 at least in the presence of low levels of DNA damage. Mild resistance to gimatecan was observed in cells transfected with TDP1 cDNA using clonogenic assays, and this feature was associated with a decreased level of single-strand breaks after drug exposure. Overall, our findings support that TDP1 participates in cellular resistance to camptothecins as suggested by increased expression in resistant cells, and as supported by reduced levels of damage in cells transfected with TDP1 full-lenght cDNA. However, TDP1 alone cannot account for relevant levels of resistance as documented by loss and gain of function approaches. Its role in repair of Topo I-mediated DNA lesions appears dispensable. The cooperation between TDP1 and other pathways in regulating sensitivity to camptothecins is the most likely event, but critical inter-players of TDP1 in cell response to gimatecan still need to be identified. In conclusion, TDP1 per se does not appear to be an attractive target for camptothecin-based antitumor treatment. However, it is conceivable that inhibition of TDP1 in tumor cells exhibiting defects in other pathways playing a role in repair of Topo I-mediated damage could favour cell death after exposure to camptothecins. Since tumor cells may exhibit checkpoint defects, the interest of co-targeting of TDP1 and other putative co-targets should be pursued and is expected to further dissect out the most critical aspects of repair of Topo I-mediated damage.