Le Fatty Acid-Binding Proteins (FABPS) sono proteine intracellulari in grado di legare gli acidi grassi a catena lunga con elevata affinità, regolandone il trasporto all’interno delle cellule. Nell’uomo sono state finora identificate 9 diverse isoforme, ciascuna con un diverso profilo di espressione a livello di tessuti. La proteina heart-type FABP (H-FABP) da anni è considerata uno tra i più sensibili ed efficienti marcatori di danno cerebrale e al miocardio, ma la sua elevata espressione in differenti tessuti non la rende un marker specifico di un particolare disordine. Un’altra isoforma espressa nel cervello, chiamata BFABP (brain-type FABP), potrebbe invece rappresentare un marcatore specifico di danno cerebrale, essendo la sua espressione limitata al tessuto nervoso. Questo lavoro ha avuto come scopo la generazione di anticorpi in grado di riconoscere la proteina B-FABP in modo specifico e selettivo. Il progetto si è articolato in due fasi. Nella prima parte del lavoro la proteina ricombinante B-FABP è stata espressa in E. coli e purificata mediante due successive cromatografie. Essa è stata quindi inoculata in conigli New Zealand e in topi BalbC, ottenendo dopo diverso tempo 2 antisieri e 8 diverse cellule ibridoma. Gli anticorpi presenti nel siero e nel surnatante delle cellule ibridoma in coltura hanno evidenziato diversi gradi di affinità nei confronti delle due isoforme, BFABP e H-FABP; solamente una cellula ibridoma è stata in grado di produrre un anticorpo specifico e selettivo per la B-FABP ma purtroppo i successivi passaggi di subclonaggio della cellula hanno evidenziato una progressiva diminuzione dell’attività anticorpale, non permettendo l’utilizzo di questo reagente per l’individuazione della proteina stessa in campioni biologici. Nella seconda parte del lavoro si è quindi cercato di analizzare e superare le problematiche riscontrate nella prima fase mediante un nuovo approccio che, con l’ausilio di software specifici, ha mirato all’identificazione di due regioni potenzialmente antigeniche della proteina stessa. Due peptidi sintetici, di sequenza identica alle regioni identificate, sono stati inoculati in conigli New Zealand con l’ottenimento di due anticorpi policlonali, pAb 2979/2980 e pAb 2981/2982. Questi anticorpi si sono rivelati specifici e selettivi verso l’isoforma B-FABP e non hanno evidenziato reazioni di cross-reazione verso H-FABP. Si può quindi affermare come l’approccio sperimentale utilizzato abbia contribuito al raggiungimento dell’obiettivo, la produzione di un anticorpo specifico per B-FABP umana. Questo risultato suggerisce possibili scenari nell’utilizzo futuro degli anticorpi, in tecniche ELISA e western blot, per valutare se la proteina B-FABP possa essere considerata un marcatore ideale, specifico di danno neuronale, in disordini a diversa eziologia (ischemica, infettiva o degenerativa).

Fatty acid–binding proteins (FABPs) are abundant intracellular proteins that bind long-chain fatty acids with high affinity. 9 different FABPs, with tissuespecific distribution, have been identified so far. The primary role of all the FABP family members is regulation of fatty acid uptake and intracellular transport. Heart-type FABP (H-FABP) is considered one of the most sensible and efficient markers of heart and brain damage, but to date the cross-reactivity limits its specific use. Brain-type FABP (B-FABP) might be considered as a good marker of brain damage, being expressed only in the nervous tissue. The aim of this work was to generate a diagnostic reagent specific for human B-FABP, not cross-reacting with H-FABP. The work has been articulated in two parts: in the first one, recombinant protein B-FABP was expressed in E. coli cells and purified by two subsequent chromatographies. The protein was then utilized as immunogen in New Zealand rabbits and BalbC mice, obtaining two antisera and 8 different hybridoma cells. The antibodies in the rabbit serum and in culture supernatant of hybridoma cells displayed different degrees of affinity for B-FABP and H-FABP; only one hybridoma cell was able to produce antibodies specific and selective for brain-type FABP, but the antibody low-titer level and the activity decrease after subsequent subcloning steps affected its application on B-FABP detection in biological fluids. To overcome the limits encountered in the first part of work, a computer-assisted approach on B-FABP was employed in order to identify the potentially most antigenic regions of the protein. Two synthetic peptides were produced with the selected sequences and inoculated in rabbits. Two polyclonal antibodies were obtained, pAb 2979/2980 and pAb 2981/2982. They showed specific and selective reactivity for human B-FABP, without crossreactions with H-FABP. Taken together, our experimental approach was effective for the generation of specific α-B-FABP antibodies; these results suggest the antibodies obtained could be utilized in ELISA and immunoblot analyses in order to value B-FABP as marker of neurological disorders with ischemic, infective and degenerative etiology.

Fatty acid-binding proteins as markers of brain injury

CRACCO, Laura
2009-01-01

Abstract

Fatty acid–binding proteins (FABPs) are abundant intracellular proteins that bind long-chain fatty acids with high affinity. 9 different FABPs, with tissuespecific distribution, have been identified so far. The primary role of all the FABP family members is regulation of fatty acid uptake and intracellular transport. Heart-type FABP (H-FABP) is considered one of the most sensible and efficient markers of heart and brain damage, but to date the cross-reactivity limits its specific use. Brain-type FABP (B-FABP) might be considered as a good marker of brain damage, being expressed only in the nervous tissue. The aim of this work was to generate a diagnostic reagent specific for human B-FABP, not cross-reacting with H-FABP. The work has been articulated in two parts: in the first one, recombinant protein B-FABP was expressed in E. coli cells and purified by two subsequent chromatographies. The protein was then utilized as immunogen in New Zealand rabbits and BalbC mice, obtaining two antisera and 8 different hybridoma cells. The antibodies in the rabbit serum and in culture supernatant of hybridoma cells displayed different degrees of affinity for B-FABP and H-FABP; only one hybridoma cell was able to produce antibodies specific and selective for brain-type FABP, but the antibody low-titer level and the activity decrease after subsequent subcloning steps affected its application on B-FABP detection in biological fluids. To overcome the limits encountered in the first part of work, a computer-assisted approach on B-FABP was employed in order to identify the potentially most antigenic regions of the protein. Two synthetic peptides were produced with the selected sequences and inoculated in rabbits. Two polyclonal antibodies were obtained, pAb 2979/2980 and pAb 2981/2982. They showed specific and selective reactivity for human B-FABP, without crossreactions with H-FABP. Taken together, our experimental approach was effective for the generation of specific α-B-FABP antibodies; these results suggest the antibodies obtained could be utilized in ELISA and immunoblot analyses in order to value B-FABP as marker of neurological disorders with ischemic, infective and degenerative etiology.
2009
fatty acid-binding proteins; brain injury
Le Fatty Acid-Binding Proteins (FABPS) sono proteine intracellulari in grado di legare gli acidi grassi a catena lunga con elevata affinità, regolandone il trasporto all’interno delle cellule. Nell’uomo sono state finora identificate 9 diverse isoforme, ciascuna con un diverso profilo di espressione a livello di tessuti. La proteina heart-type FABP (H-FABP) da anni è considerata uno tra i più sensibili ed efficienti marcatori di danno cerebrale e al miocardio, ma la sua elevata espressione in differenti tessuti non la rende un marker specifico di un particolare disordine. Un’altra isoforma espressa nel cervello, chiamata BFABP (brain-type FABP), potrebbe invece rappresentare un marcatore specifico di danno cerebrale, essendo la sua espressione limitata al tessuto nervoso. Questo lavoro ha avuto come scopo la generazione di anticorpi in grado di riconoscere la proteina B-FABP in modo specifico e selettivo. Il progetto si è articolato in due fasi. Nella prima parte del lavoro la proteina ricombinante B-FABP è stata espressa in E. coli e purificata mediante due successive cromatografie. Essa è stata quindi inoculata in conigli New Zealand e in topi BalbC, ottenendo dopo diverso tempo 2 antisieri e 8 diverse cellule ibridoma. Gli anticorpi presenti nel siero e nel surnatante delle cellule ibridoma in coltura hanno evidenziato diversi gradi di affinità nei confronti delle due isoforme, BFABP e H-FABP; solamente una cellula ibridoma è stata in grado di produrre un anticorpo specifico e selettivo per la B-FABP ma purtroppo i successivi passaggi di subclonaggio della cellula hanno evidenziato una progressiva diminuzione dell’attività anticorpale, non permettendo l’utilizzo di questo reagente per l’individuazione della proteina stessa in campioni biologici. Nella seconda parte del lavoro si è quindi cercato di analizzare e superare le problematiche riscontrate nella prima fase mediante un nuovo approccio che, con l’ausilio di software specifici, ha mirato all’identificazione di due regioni potenzialmente antigeniche della proteina stessa. Due peptidi sintetici, di sequenza identica alle regioni identificate, sono stati inoculati in conigli New Zealand con l’ottenimento di due anticorpi policlonali, pAb 2979/2980 e pAb 2981/2982. Questi anticorpi si sono rivelati specifici e selettivi verso l’isoforma B-FABP e non hanno evidenziato reazioni di cross-reazione verso H-FABP. Si può quindi affermare come l’approccio sperimentale utilizzato abbia contribuito al raggiungimento dell’obiettivo, la produzione di un anticorpo specifico per B-FABP umana. Questo risultato suggerisce possibili scenari nell’utilizzo futuro degli anticorpi, in tecniche ELISA e western blot, per valutare se la proteina B-FABP possa essere considerata un marcatore ideale, specifico di danno neuronale, in disordini a diversa eziologia (ischemica, infettiva o degenerativa).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11562/337348
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