Identificazione, caratterizzazione ed analisi funzionale di un fattore di trascrizione MYB di Vitis vinifera putativamente coinvolto nella regolazione della biosintesi dei benzenoidi volatili

Nella bacca di Vitis vinifera vengono sintetizzati i maggiori composti responsabili del profumo del colore e dell’aroma del vino. I costituenti di profumo e aroma consistono in acidi organici, protoantocianidine, terpenoidi, e vari precursori di aldeidi aromatiche, esteri, tioli e benzenoidi che vengono accumulati nei vacuoli dell’esocarpo (Lund and Bohlmann, 2006). Per quanto riguarda la regolazione della sintesi dei benzenoidi, al momento è stato identificato un solo gene regolatore, ODORANT1, codificante una proteina MYB che controlla la sintesi dei composti volatili da parte del fiore di Petunia hybrida cv. Mitchell (W115). Questo fattore di trascrizione è necessario per l’espressione di geni della via dell’acido scichimico, in particolare attivando il promotore del gene della 5-enol-piruvilscichimato-3-fosfatasi (EPSPs). In petunia, quindi, la regolazione della sintesi dei composti volatili avviene a livello della produzione dei precursori (Verdonk et al, 2005; Ben Zvi et al, 2008). In questo studio si vogliono isolare e studiare i geni coinvolti nella sintesi dei principali benzenoidi fenolici come la benzaldeide (sentore amaro, di mandorla in vino), la fenilacetaldeide, l’alcol benzilico, l’alcol feniletilico (profumo di rosa) e la vanillina (profumo di vaniglia) che si formano nella buccia della bacca di vite durante la maturazione e che sono coinvolti nello sviluppo dell’aroma primario del vino (Garcia et al, 2003). La sequenza aminoacidica di ODORANT1 di petunia è stata utilizzata per effettuare analisi BLASTP contro il “Genoscope Blast server” (www.genoscope.cns.fr) sul genoma della vite (French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, 2007). Sono stati individuati tre putativi geni di vite con la migliore omologia di sequenza aminoacidica PhODO1: VvODO3 (58% di omologia), VvODO2 (53% di omologia) e VvODO1 (51% di omologia). E’ stato studiato il livello di espressione di ognuno dei tre geni di vite individuati negli organi riproduttivi e vegetativi della pianta di V. vinifera cv. Corvina mediante esperimenti di Real-Time RT-PCR. Secondo i livelli di trascritto registrati, ognuno di questi geni di vite può essere coinvolto nella regolazione della sintesi dei precursori dei benzenoidi volatili in modo organo specifico. Durante lo sviluppo, la maturazione e l’appassimento è stato studiato anche il profilo trascrizionale di questi geni regolatori in bacche intere di V. vinifera cv. Corvina campionate nella stagione 2006. Dai risultati è emerso che la modulazione dell’espressione di questi geni avviene durante la prima fase dello sviluppo della bacca, prima dell’invaiatura. Lo studio funzionale dei geni ODORANT di vite è stato avviato attraverso la “sovra espressione” eterologa in piante di petunia wild type. P. hybrida cv. Mitchell è stata ingegnerizzata introducendo VvODO1, VvODO2, VvODO3 separatamente e indipendentemente sotto il controllo del promotore forte e costitutivo CaMV-35S. Le piante transgeniche rigenerate sono state esaminate mediante lo studio dei livelli di espressione dei geni strutturali della via dell’acido scichimico e mediante lo studio della produzione di benzenoidi dal fiore. Per studiare i composti benzenoidi prodotti dai fiori di petunia in vivo, e per captare le emissioni durante lo sviluppo del fiore, è stata posta una colonna SPME a raccolta dei prodotti del fiore, che è stata successivamente eluita e sottoposta ad analisi gas cromatografiche accoppiate alla massa. Dall’interpretazione degli spettri ottenuti dalla GC-MS, risulta evidente che “sovra esprimendo” il fattore di trascrizione di vite ODO3, i livelli di produzione delle molecole benzenoidi aumentano, nonostante, le analisi dei livelli di trascritti dimostrino che alcuni dei più importanti geni coinvolti nell’intero processo non subiscano serie modulazioni.

The Vitis vinifera berry synthesizes the major determinants of the wine flavours, aromas, and colours. Flavours arise from volatile compounds, such as terpenes, norisoprenoids, and thiols stored as sugar or amino acid conjugates in the vacuoles of exocarp cells (Lund and Bohlmann, 2006). From the scent producing P. hybrida cv Mitchell was recently identified ODORANT1, an R2R3MYB-type transcription factor, which controls the synthesis of volatile benzenoids and regulates, at transcriptional level, shikimate pathway by the ability to activate EPSPs promoter (Verdonk et al, 2005; Ben Zvi et al, 2008). In this study we would like to identify genes involved in the synthesis of the principal volatile phenolic-benzenoids such as benzaldehyde (bitter almond taste in wine), phenylacetaldhyde, benzyll alcohol, 2-phenylethanol (rose) and vanilline (vanilla) that are found mainly in grape berry skin and that are involved in the primary aromas developing during berry ripening (Garcia et al, 2003). BlastP analyses were performed against the Genoscope Blast Server (www.genoscope.cns.fr) using the Petunia ODO1 sequence against the grapevine genome (French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, 2007). Three putative grapevine genes with the best amino acidic homology to PhODO1 were identified: VvODO3 (58% homology), VvODO2 (53% homology) and VvODO1 (51% homology). The expression level of each grapevine gene was analyzed in developing vegetative and reproductive organs of plants of V. vinifera cv. Corvina (clone 48) by Real-Time RT-PCR experiments. The results suggest that the three genes could be involved in the regulation of the synthesis of volatile benzenoids precursors in an organ specific way. The transcriptional profile of these regulatory genes was also studied during development, and withering of berries of V. vinifera cv. Corvina sampled in the season 2006. The results showed that the regulation of the volatile benzenoids synthesis seems to occur during the first phase of the berry development. VvODO1, VvODO2, VvODO3 were independently over-expressed in P. hybrida cv. Mitchell plants. Transgenic petunia plants and their flowers, expressing the heterologous genes, were analyzed for the expression levels of structural genes and their floral scent production. To analyze volatile compounds produced by petunia flowers in vivo, and to be able to follow volatile release during flower development, a Solid Phase Micro Extraction (SPME) device is placed in the floral headspace, which is subsequently analyzed by GC-MS. From the results of the analysis of the GC-MS spectra, it was clear that over-expressing VvODO3 increased the production levels of benzenoids molecules, despite the unchanged RNA levels of the major genes involved in the biosynthesis process.