Studio delle interazioni della oncoproteina Tax dei retrovirus HTLV con i fattori cellulari della via NF-kB

I retrovirus umani leucemogeni delle cellule T di tipo 1 e 2 (HTLV-1 e HTLV-2) sono virus oncogeni responsabili di malattie linfoproliferative e neurodegenerative nell’uomo. Un ruolo determinante nel processo di trasformazione cellulare indotto da HTLV è attribuito alla proteina trans-regolatoria Tax, codificata dall’mRNA virale pX. L’oncoproteina Tax di HTLV-1 (Tax-1) è in grado di riprogrammare la progressione dalla fase G1 ad S del ciclo cellulare attraverso molteplici processi molecolari quali il legame diretto di proteine, la repressione o induzione trascrizionale e le modificazioni post-traduzionali. La proteina Tax di HTLV-2 (Tax-2), confrontata con Tax-1, presenta più del 70% di identità aminoacidica; tuttavia dimostra una ridotta attività trasformante rispetto la sua omologa. Questa diversità nella attività patogenetica rende lo studio strutturale e funzionale delle proteine Tax estremamente promettente per la comprensione dei meccanismi cellulari che più specificamente intervengono nella oncogenesi. Tax-1 è una proteina di circa 40 kDa che regola la trascrizione virale attraverso la mediazione di proteine cellulari coinvolte in diversi pathway. Evidenze sperimentali dimostrano che l’attivazione costituiva del signaling NF-kB da parte di Tax-1 è essenziale per la trasformazione e che Tax-1 interagisce con numerosi fattori di questa cascata. Meno note sono le interazioni di Tax-2 con i fattori della stessa via. Scopo della presente ricerca è la definizione di omologie e differenze funzionali tra Tax-2 e Tax-1 nell’attivazione costitutiva del pathway NF-kB. Abbiamo quindi intrapreso uno studio sulle interazioni di Tax-2 con proteine coinvolte nel signaling di NF-kB e sul contributo delle modificazioni post-traduzionali di Tax-1 nell’interazione proteina-proteina. Sono stati scelti tre fattori coinvolti nell’induzione della via canonica NF-kB: il fattore di trascrizione p65/RelA, l’attivatore a monte della via in esame TAB2, e la chinasi IKKe. In questo lavoro di ricerca, per la prima volta si riportano dati che indicano il coinvolgimento del fattore di trascrizione p65/RelA e della proteina TAB2 (TAK1 binding protein 1) nell’attivazione costitutiva della cascata NF-kB indotta dalla proteina virale Tax-2B. Si dimostra, infatti, l’associazione tra Tax-2B e i fattori p65/RelA e TAB2 in saggi di co-immunoprecipitazione in cellule umane e, mediante saggi di luciferasi, si evidenzia l’effetto cooperativo di p65/RelA e/o TAB2 nell’attivazione indotta da Tax-2 dell’espressione da un promotore NF-kB. Il riconoscimento Tax-2/p65 è stato dimostrato inoltre mediante saggi in vitro GST-pull-down. Si dimostra, inoltre, che il riconoscimento di Tax-2 avviene tramite il dominio di TAB2 presente nella regione N-terminale, il quale è necessario per la formazione di un complesso che attivi la cascata NF-kB. Alla luce dei dati qui presentati, si conferma la rilevanza delle interazioni delle proteine Tax con i fattori p65 o TAB2 nell’attivazione della via di segnalazione NF-kB. Lo studio dell’interazione delle proteine Tax con fattori coinvolti nel signaling NF-kB, utilizzando la stessa metodologia, ha individuato una nuova interazione tra le proteine virali Tax-1 e Tax-2B e il fattore IKKe, una chinasi che media la fosforilazione inducibile di p65/RelA e dell’inibitore citoplasmatico IkBa. In considerazione del contributo delle modifiche post-traduzionali di Tax-1 nell’induzione della via NF-kB e nell’associazione con fattori cellulari, è stata testata, in co-immunoprecipitazione, l’abilità di mutanti di Tax-1 di riconoscere p65, TAB2 o IKKe. I risultati di questi esperimenti escludono un ruolo delle modifiche post-traduzionali di Tax-1 nel legame con questi fattori. In conclusione, i dati prodotti in questi studi suggeriscono che Tax-1 e Tax-2B mostrano una capacità simile, ma non identica, di associare e attivare fattori del pathway NF-kB canonico, e che le differenze tra le due proteine virali nella capacità di deregolare le vie di trasduzione del segnale siano da attribuire, almeno parzialmente, alle diversità nell’interazioni con i fattori coinvolti nel pathway NF- kB non-canonico. Successivi studi di associazione con fattori cellulari specificamente coinvolti nella via NF-kB alternativa contribuiranno a chiarire questa ipotesi.

Human T-cell lymphotropic viruses type 1 and type 2 (HTLV-1 and HTLV-2) are related oncoviruses that have been associated with lymphoproliferative and neurodegenerative disorders. The transactivator Tax protein, encoded by the pX region of HTLV genome, is a key factor in cellular transformation. HTLV-1 Tax oncoprotein (Tax-1) reprograms G1 to S progression through multiple mechanistic ways as well as protein-protein binding, transcriptional induction/repression, and post-translational modifications. HTVL-2 Tax (Tax-2) shares more than 70% aa homology whit Tax-1, however Tax-2 has a lower transforming activity than Tax-1. Based on this difference the structural and functional study of Tax proteins can be useful to understand the cellular mechanisms that more specifically take part in oncogenesis. Tax-1 is a 40 KDa transactivator protein which regulates viral transcription by modulating the activity of cellular factors involved in several signal transduction pathways. Tax-1 activation of NF-kB signalling is critical for cellular transformation and while its interaction with NF-kB factors have been intensively investigated little is known about Tax-2 interaction with cellular proteins of this pathway. The aim of this research is the comparison of Tax-2 and Tax-1 for the ability to activate NF-kB pathway. We studied Tax-2 interactions with factors of NF-kB signalling and the contribution of Tax-1 post-translational modifications in the protein-protein interaction. We chose three factors involved in the canonical NF- kB cascade: the transcription factor p65/RelA, the upstream signaling activator TAB2, and the IKKe kinase. In this research, we provide, for the first time, evidence of the involvement of the transcription factor p65/RelA and the protein TAB2 (TAK1 binding protein 1) in Tax-2B-mediated NF-kB activation. In fact, we demonstrate the association of Tax-2B with p65/RelA and TAB2 in co-immunoprecipitation assays in human cells and, by luciferase assays, we highlight the cooperative effect of p65 and/or TAB2 on Tax-2-mediated gene expression activation from NF-kB promoter. Tax- 2/p65 recognition was also shown by in vitro GST-pull-down assays. We also demonstrate that TAB2 is interacting with Tax-2B through a domain that is necessary to form a complex that activates NF-kB cascade. Further analysis of Tax interaction with cellular factors involved in the NF-kB signaling, using the same methodology, identifies a novel interaction between Tax-1 and Tax-2 and IKKe factor, a kinase that mediates inducible phosphorylation of p65/RelA and IkBa. Considering the contribution of Tax-1 post-translational modifications in NF-kB induction and in association with cellular factors, we tested the ability of specific Tax-1 mutants to recognize p65, TAB2 and IKKe by co-immunoprecipitation experiments. The results of this analysis exclude a role of Tax-1 post-translational modifications in the association with these factors. In conclusion, the results obtained in the present study, suggest that Tax-1 and Tax-2B share similar, though not identical, abilities to associate and activate factors of canonical NF-kB pathway. Although we cannot at present explain this diversity, it is tempting to speculate that the differences of the two viral proteins in deregulating signal transduction pathways might be partially attributed to their different capacities to interact with non-canonical NF-kB pathway factors. Comparative studies of Tax-1 and Tax-2 association with cellular factors specifically involved in alternative NF-kB signaling will give new insight to clarify this hypothesis.