Recent advancements in Next-Generation Sequencing (NGS) technologies, particularly Whole Genome Sequencing (WGS) and Whole Metagenome Sequencing (WMS) applications, have become essential in food systems. These techniques are crucial for taxonomic identification, safety assessment and functional characterization of food-grade microorganisms, especially unlocking their potential in antimicrobial compound production. The rising threat of AMR prompted the European Food Safety Authority (EFSA) to suggest mitigation measures, including the use of safe strains in the food and feed chain and natural antimicrobials to preserve existing antimicrobials' effectiveness. In this context, the present Ph.D. research aims to develop and implement bioinformatic pipelines for analyzing genomic and metagenomic data. The objectives are to identify, discover, and detect antimicrobial resistances and explore the potential of food bacteria and yeasts in producing antimicrobial compounds to prevent the spread of antibiotic resistance in the food chain. Over three years, four research lines were established: 1) exploring antibiotic resistance diversity in Leuconostoc spp., with a genome-based approach; 2) assessing the safety and investigating antimicrobial compounds in non-QPS Liquorilactobacillus strains, focusing on L. nagelii VUCC-R001, a strain isolated from kombucha tea; 3) the bioprospecting of the unconventional yeast Metschnikowia pulcherrima, increasing the available genomic resources to: i.) define its taxonomic position, ii.) develop a pipeline for its safety assessment and iii). explore the potential of its pulcherrimin production as antimicrobial compound; and 4) exploring the resistome in infant gut microbiomes to analyze the spread of antibiotic resistances in early life. For Leuconostoc spp., which are worldwide used as starter cultures for fermented food production, the antibiotic resistant gene lsaA was identified in L. fallax and L. pseudomesenteroides type strains for the first time with the potential to spread along the food chain. For L. nagelii VUCC-R001, isolated from kombucha tea, safety was confirmed through genotype-phenotype analysis, showing intrinsic vancomycin resistance. Additionally, it produces D-phenyllactic acid and dextran. Two studies were developed for the analysis of Metschnikowia pulcherrima species, ubiquitous yeasts of interest for aroma in fermented beverages, biocontrol potential and antimicrobial activity against plant pathogens. The first study, described a bioinformatic workflow to calculate similarity of DBT012 strain with the M. pulcherrima clade publicly available genomes. It concluded that it belongs to the species M. pulcherrima, reinforcing the recent reclassification in one taxon. In the second study, the genomes of four M. pulcherrima strains were sequenced, detecting variants for pulcherrimin genes, an arsenal of CAZymes and an intermediate sensibility for itraconazole in all the strains analyzed. The last section is on the investigation of infant gut resistome, screening eight targeted datasets from public databases, especially focusing on Lactobacillaceae and Bifidobacteriaceae families. A gene catalog was built, and it revealed high occurrences of resistance genes for vancomycin, disinfectants, and tetracycline, linked to clinically relevant genera. Correspondence analysis showed significant associations between antibiotic resistance genes (ARGs) and lifestyle factors. Finally, this project highlights the significance of genomics and metagenomics in exploring ARGs and antimicrobial compounds in non-conventional microorganisms, with implications for agriculture, food systems, and human and animal health. For these reasons, developing species/genus-specific bioinformatic pipelines for safety assessment in combination with wet lab validation for QPS inclusion is obligatory.

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), in particolare nelle applicazioni di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) e il sequenziamento dell'intero metagenoma (WMS), sono diventati essenziali nei sistemi alimentari. Queste tecniche sono cruciali per l'identificazione tassonomica, la valutazione della sicurezza e la caratterizzazione funzionale dei microrganismi di origine alimentare, in particolare per rivelarne il potenziale nella produzione di composti antimicrobici. La crescente minaccia della resistenza antimicrobica ha spinto l'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA) a suggerire misure di mitigazione, tra cui l'uso di ceppi sicuri e antimicrobici naturali nella catena alimentare e dei mangimi per preservare l'efficacia degli antimicrobici esistenti. In questo contesto, la presente ricerca di dottorato mira a sviluppare e implementare pipeline bioinformatiche per l'analisi di dati genomici e metagenomici. Gli obiettivi sono identificare, scoprire e rilevare resistenze antimicrobiche ed esplorare il potenziale racchiuso in batteri e lieviti provenienti da alimenti, nella produzione di composti antimicrobici per prevenire la diffusione di resistenze nella catena alimentare. Nel corso dei tre anni, sono state stabilite quattro linee di ricerca: 1) esplorare la diversità delle resistenze agli antibiotici nei Leuconostoc spp. con un approccio basato sul genoma; 2) valutare la sicurezza e investigare i composti antimicrobici in ceppi di Liquorilactobacillus non-QPS, focalizzandosi su L. nagelii VUCC-R001, un ceppo isolato da kombucha; 3) la bio-prospezione del lievito non convenzionale Metschnikowia pulcherrima, aumentando le risorse genomiche disponibili per: i) definire la sua posizione tassonomica, ii) sviluppare una pipeline per la valutazione della sua sicurezza e iii) esplorare il potenziale della produzione di pulcherrimina come composto antimicrobico; e 4) esplorare il resistoma in microbiomi intestinali di neonati per analizzare la diffusione delle resistenze agli antimicrobici nella prime fasi di vita. Per i Leuconostoc spp., utilizzati in tutto il mondo come colture starter per la produzione di alimenti fermentati, il gene lsaA, responsabile di antibiotico-resistenza, è stato identificato per la prima volta nei ceppi tipo di L. fallax e L. pseudomesenteroides con il potenziale di diffondersi lungo la catena alimentare. Per L. nagelii VUCC-R001, isolato da kombucha, la sicurezza è stata confermata tramite analisi genotipo-fenotipo, mostrando resistenza intrinseca alla vancomicina. Inoltre, è in grado di produrre acido D-fenilattico e destrano. Sono stati sviluppati due studi per l'analisi della specie Metschnikowia pulcherrima, di cui fanno parte lieviti ubiquitari di interesse per l’aroma conferito alle bevande fermentate, per il potenziale di biocontrollo nelle matrici alimentari e l'attività antimicrobica contro i patogeni vegetali. Il primo studio ha descritto un workflow bioinformatico per calcolare la somiglianza del genoma del ceppo DBT012 con i genomi pubblici disponibili del clade M. pulcherrima. Il risultato è stato che DBT012 appartiene alla specie M. pulcherrima, rafforzando la recente riclassificazione in un unico taxon. Nel secondo studio sono stati sequenziati i genomi di quattro ceppi di M. pulcherrima, rilevando varianti dei geni della pulcherrimina, un arsenale di CAZymes e una sensibilità intermedia all'itraconazolo in tutti i ceppi analizzati. L'ultima sezione riguarda l'indagine sul resistoma intestinale di infanti, in cui sono stati esaminati otto dataset provenienti da banche dati pubbliche, concentrandosi in particolare sulle famiglie Lactobacillaceae e Bifidobacteriaceae. È stato costruito un catalogo di geni che ha rivelato elevate occorrenze di geni di resistenza per vancomicina, disinfettanti e tetraciclina, legati a generi clinicamente rilevanti. L'analisi delle corrispondenze ha mostrato associazioni significative tra geni di resistenza agli antibiotici (ARG) e fattori legati allo stile di vita. Infine, questo progetto evidenzia l'importanza della genomica e della metagenomica nell'esplorazione di ARG e dei composti antimicrobici in microrganismi non convenzionali, con implicazioni per l'agricoltura, i sistemi alimentari e la salute umana e animale. Per questi motivi, è obbligatorio sviluppare pipeline bioinformatiche specifiche per specie o genere per la valutazione della sicurezza in combinazione con la validazione in laboratorio al fine di includerli nella lista QPS.

Genomics and metagenomics as powerful tools for antimicrobial mechanisms exploration and bioprospecting in food and health applications

Larini, Ilaria
2024-01-01

Abstract

Recent advancements in Next-Generation Sequencing (NGS) technologies, particularly Whole Genome Sequencing (WGS) and Whole Metagenome Sequencing (WMS) applications, have become essential in food systems. These techniques are crucial for taxonomic identification, safety assessment and functional characterization of food-grade microorganisms, especially unlocking their potential in antimicrobial compound production. The rising threat of AMR prompted the European Food Safety Authority (EFSA) to suggest mitigation measures, including the use of safe strains in the food and feed chain and natural antimicrobials to preserve existing antimicrobials' effectiveness. In this context, the present Ph.D. research aims to develop and implement bioinformatic pipelines for analyzing genomic and metagenomic data. The objectives are to identify, discover, and detect antimicrobial resistances and explore the potential of food bacteria and yeasts in producing antimicrobial compounds to prevent the spread of antibiotic resistance in the food chain. Over three years, four research lines were established: 1) exploring antibiotic resistance diversity in Leuconostoc spp., with a genome-based approach; 2) assessing the safety and investigating antimicrobial compounds in non-QPS Liquorilactobacillus strains, focusing on L. nagelii VUCC-R001, a strain isolated from kombucha tea; 3) the bioprospecting of the unconventional yeast Metschnikowia pulcherrima, increasing the available genomic resources to: i.) define its taxonomic position, ii.) develop a pipeline for its safety assessment and iii). explore the potential of its pulcherrimin production as antimicrobial compound; and 4) exploring the resistome in infant gut microbiomes to analyze the spread of antibiotic resistances in early life. For Leuconostoc spp., which are worldwide used as starter cultures for fermented food production, the antibiotic resistant gene lsaA was identified in L. fallax and L. pseudomesenteroides type strains for the first time with the potential to spread along the food chain. For L. nagelii VUCC-R001, isolated from kombucha tea, safety was confirmed through genotype-phenotype analysis, showing intrinsic vancomycin resistance. Additionally, it produces D-phenyllactic acid and dextran. Two studies were developed for the analysis of Metschnikowia pulcherrima species, ubiquitous yeasts of interest for aroma in fermented beverages, biocontrol potential and antimicrobial activity against plant pathogens. The first study, described a bioinformatic workflow to calculate similarity of DBT012 strain with the M. pulcherrima clade publicly available genomes. It concluded that it belongs to the species M. pulcherrima, reinforcing the recent reclassification in one taxon. In the second study, the genomes of four M. pulcherrima strains were sequenced, detecting variants for pulcherrimin genes, an arsenal of CAZymes and an intermediate sensibility for itraconazole in all the strains analyzed. The last section is on the investigation of infant gut resistome, screening eight targeted datasets from public databases, especially focusing on Lactobacillaceae and Bifidobacteriaceae families. A gene catalog was built, and it revealed high occurrences of resistance genes for vancomycin, disinfectants, and tetracycline, linked to clinically relevant genera. Correspondence analysis showed significant associations between antibiotic resistance genes (ARGs) and lifestyle factors. Finally, this project highlights the significance of genomics and metagenomics in exploring ARGs and antimicrobial compounds in non-conventional microorganisms, with implications for agriculture, food systems, and human and animal health. For these reasons, developing species/genus-specific bioinformatic pipelines for safety assessment in combination with wet lab validation for QPS inclusion is obligatory.
2024
Metagenomics
Antimicrobials
Antibiotic resistance
Bioinformatic pipeline
Antimicrobials resistance
Safety assessment
Genomics
I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), in particolare nelle applicazioni di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) e il sequenziamento dell'intero metagenoma (WMS), sono diventati essenziali nei sistemi alimentari. Queste tecniche sono cruciali per l'identificazione tassonomica, la valutazione della sicurezza e la caratterizzazione funzionale dei microrganismi di origine alimentare, in particolare per rivelarne il potenziale nella produzione di composti antimicrobici. La crescente minaccia della resistenza antimicrobica ha spinto l'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA) a suggerire misure di mitigazione, tra cui l'uso di ceppi sicuri e antimicrobici naturali nella catena alimentare e dei mangimi per preservare l'efficacia degli antimicrobici esistenti. In questo contesto, la presente ricerca di dottorato mira a sviluppare e implementare pipeline bioinformatiche per l'analisi di dati genomici e metagenomici. Gli obiettivi sono identificare, scoprire e rilevare resistenze antimicrobiche ed esplorare il potenziale racchiuso in batteri e lieviti provenienti da alimenti, nella produzione di composti antimicrobici per prevenire la diffusione di resistenze nella catena alimentare. Nel corso dei tre anni, sono state stabilite quattro linee di ricerca: 1) esplorare la diversità delle resistenze agli antibiotici nei Leuconostoc spp. con un approccio basato sul genoma; 2) valutare la sicurezza e investigare i composti antimicrobici in ceppi di Liquorilactobacillus non-QPS, focalizzandosi su L. nagelii VUCC-R001, un ceppo isolato da kombucha; 3) la bio-prospezione del lievito non convenzionale Metschnikowia pulcherrima, aumentando le risorse genomiche disponibili per: i) definire la sua posizione tassonomica, ii) sviluppare una pipeline per la valutazione della sua sicurezza e iii) esplorare il potenziale della produzione di pulcherrimina come composto antimicrobico; e 4) esplorare il resistoma in microbiomi intestinali di neonati per analizzare la diffusione delle resistenze agli antimicrobici nella prime fasi di vita. Per i Leuconostoc spp., utilizzati in tutto il mondo come colture starter per la produzione di alimenti fermentati, il gene lsaA, responsabile di antibiotico-resistenza, è stato identificato per la prima volta nei ceppi tipo di L. fallax e L. pseudomesenteroides con il potenziale di diffondersi lungo la catena alimentare. Per L. nagelii VUCC-R001, isolato da kombucha, la sicurezza è stata confermata tramite analisi genotipo-fenotipo, mostrando resistenza intrinseca alla vancomicina. Inoltre, è in grado di produrre acido D-fenilattico e destrano. Sono stati sviluppati due studi per l'analisi della specie Metschnikowia pulcherrima, di cui fanno parte lieviti ubiquitari di interesse per l’aroma conferito alle bevande fermentate, per il potenziale di biocontrollo nelle matrici alimentari e l'attività antimicrobica contro i patogeni vegetali. Il primo studio ha descritto un workflow bioinformatico per calcolare la somiglianza del genoma del ceppo DBT012 con i genomi pubblici disponibili del clade M. pulcherrima. Il risultato è stato che DBT012 appartiene alla specie M. pulcherrima, rafforzando la recente riclassificazione in un unico taxon. Nel secondo studio sono stati sequenziati i genomi di quattro ceppi di M. pulcherrima, rilevando varianti dei geni della pulcherrimina, un arsenale di CAZymes e una sensibilità intermedia all'itraconazolo in tutti i ceppi analizzati. L'ultima sezione riguarda l'indagine sul resistoma intestinale di infanti, in cui sono stati esaminati otto dataset provenienti da banche dati pubbliche, concentrandosi in particolare sulle famiglie Lactobacillaceae e Bifidobacteriaceae. È stato costruito un catalogo di geni che ha rivelato elevate occorrenze di geni di resistenza per vancomicina, disinfettanti e tetraciclina, legati a generi clinicamente rilevanti. L'analisi delle corrispondenze ha mostrato associazioni significative tra geni di resistenza agli antibiotici (ARG) e fattori legati allo stile di vita. Infine, questo progetto evidenzia l'importanza della genomica e della metagenomica nell'esplorazione di ARG e dei composti antimicrobici in microrganismi non convenzionali, con implicazioni per l'agricoltura, i sistemi alimentari e la salute umana e animale. Per questi motivi, è obbligatorio sviluppare pipeline bioinformatiche specifiche per specie o genere per la valutazione della sicurezza in combinazione con la validazione in laboratorio al fine di includerli nella lista QPS.
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