In vitro prediction of response to hCG therapy in patients with cryptorchidism and testicular torsion in a gubernaculum-based model

Andrological diseases that affect patients in pediatric age represent important risk factors for alterations of their fertile potential in adulthood and, therefore, early diagnosis and treatment, even surgical and/or therapeutic treatments, are extremely important. The best-characterized risk factor for infertility in adulthood but also for testicular cancer development is represented by cryptorchidism, which is the absence of one or both testicles in the scrotal sac at birth. The most effective approach to treat cryptorchidism is orchidopexy followed by human chorionic gonadotropin (hCG) therapy; however, not all patients show a significant improvement of testis volume and vascularization after adjuvant therapy. In this study, we generated an in vitro model to predict the patient response to hCG by cultivating and treating primary cells derived from four cryptorchid patients’ biopsies of gubernaculum testis, the ligament that connects the testicle to the scrotum. Gubernaculum shares many properties with testicular cells, including the expression of the hCG receptor (LHCGR), due to their common embryonic origin. Here, we show that hCG stimulates gubernacular cells to proliferate and to form vessel-like structures with a different extent among the four patients derived cells, together with a decrease of both oxygen consumption and reactive oxygen species generation. Hereby, we show that the diverse patient response to hCG may be ascribable to their age, as younger patients respond better in vitro to the hormone. In addition to cryptorchidism, testicular torsion also represents an urgent condition that may negatively influence the fertility potential. This pathology occurs in young men generally before the age of 25 for which a therapeutic approach is not currently considered in the postoperative phase. In this study, we also show that gubernacular cells derived from patients affected by testicular torsion can be cultured and amplified in vitro to test the efficacy of hCG therapy, which can also be used in this pathological condition to recover function of the testes. Finally, to better understand the properties of testicular tissue and its functionalities, we generated and characterized a three-dimensional human testicular organoid culture system, starting from a piece of testicular tissue biopsy. Altogether, the findings of this thesis pave the way to the future application of our in vitro gubernaculum model – preserving precious testicular tissue - to predict the best personalized therapy for cryptorchid patients and to support the testis recover in patients affected by testicular torsion.

Le malattie andrologiche che colpiscono i pazienti in età pediatrica rappresentano un importante fattore di rischio per l’alterazione del loro potenziale fertile in età adulta e, pertanto, la diagnosi ed il trattamento precoce, anche chirurgico e/o terapeutico, sono estremamente importanti. Il fattore di rischio meglio caratterizzato per l’infertilità in età adulta, così come per lo sviluppo del cancro testicolare, è rappresentato dal criptorchidismo, in cui si verifica l’assenza di uno o entrambi i testicoli nella sacca scrotale alla nascita. L'approccio più efficace per il trattamento del criptorchidismo è l'orchidopessi seguita dalla terapia con gonadotropina corionica umana (hCG); tuttavia, non tutti i pazienti mostrano un miglioramento significativo del volume e della vascolarizzazione dei testicoli dopo la terapia adiuvante. In questo studio, abbiamo generato un modello in vitro per prevedere la risposta del paziente all'hCG, attraverso la coltura e il trattamento di cellule primarie derivate da biopsie di gubernaculum testis - il legamento che collega il testicolo allo scroto - di quattro pazienti criptorchidi. Il gubernaculum condivide molte proprietà con le cellule testicolari, inclusa l'espressione del recettore dell’hCG (LHCGR), data la loro comune origine embrionale. In questo lavoro, mostriamo che l'hCG stimola le cellule gubernacolari a proliferare e a formare strutture simili a vasi con un'entità diversa tra le cellule derivate dai 4 pazienti, insieme ad una riduzione sia del consumo di ossigeno che di generazione delle specie reattive dell'ossigeno. Con queste osservazioni, mostriamo che la diversa risposta dei pazienti all'hCG può essere attribuibile alla loro età, poiché i pazienti più giovani rispondono meglio in vitro all'ormone. Oltre al criptorchidismo, anche la torsione testicolare rappresenta una condizione urgente che può influenzare negativamente il potenziale di fertilità. Questa patologia si manifesta in soggetti giovani generalmente prima dei 25 anni per i quali attualmente non è prevista alcuna terapia nella fase postoperatoria. In questo studio mostriamo anche che le cellule gubernacolari derivate da pazienti affetti da torsione testicolare possono essere coltivate e amplificate in vitro per testare l'efficacia della terapia con hCG, la cui applicazione è quindi adeguata anche in questa condizione patologica per recuperare la funzionalità testicolare. Infine, per comprendere meglio le proprietà del tessuto testicolare e le sue funzionalità, abbiamo generato e caratterizzato un sistema di coltura tridimensionale di organoidi testicolari umani, a partire da un pezzo di biopsia del tessuto testicolare. Nel complesso, i risultati di questa tesi aprono la strada alla futura applicazione del nostro modello di gubernaculum in vitro – preservando il prezioso tessuto testicolare – per prevedere la migliore terapia personalizzata per i pazienti criptorchidi e per supportare il recupero dei testicoli nei pazienti affetti da torsione testicolare.