Role of miR-204 and bioactive compounds in modulating chondrogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells

In aging-related diseases, such as osteoporosis and osteoarthritis (OA), cartilage and bone are the most commonly damaged tissues. Chondrocytes and osteocytes originate from pluripotent mesenchymal stem cells (MSCs) through chondrogenic and osteogenic differentiation; two interrelated processes. RUNX2 and SOX9 are the major transcription factors for osteogenesis and chondrogenesis, respectively. They directly interact and can inhibit each other’s transactivation. Epigenetic regulation by miRNA greatly influences the differentiation fate of MSCs. It has been found that miR-204 binds to the 3’-UTR of RUNX2 mRNA and that its expression is promoted by SOX9. Inflammation has been shown to impair MSCs chondrogenic and osteogenic differentiation. Methylsulfonylmethane (MSM) and fisetin, two nutraceutical compounds with anti-inflammatory and antioxidant properties, have been proved to be effective in the management of cartilage and bone degenerative disorders. In this study, we elucidated the miR-204 role during MSCs’ commitment and differentiation steps and investigated the overall effects of MSM and fisetin on chondrogenesis and osteogenesis. The analyses were conducted both in vitro and in vivo. The silencing of miR-204 activity in MSCs enhanced the expression of chondrogenic (SOX9, COMP, COL2A1) and osteogenic (COL1A1) maturation-related genes during the early MSCs differentiation phase. On the contrary, the absence of miR-204 activity considerably affected the chondroblasts’ and osteoblasts’ maturation during the late MSCs differentiation phase. RUNX2 expression was slightly altered in miR-204 silenced cells compared to control, although RUNX2 protein levels were increased. In vivo, miR-204 expression increased during zebrafish larval development and up to six months of growth, but then it dropped as zebrafish grew older. Interestingly, β-catenin and p-ERK protein levels decreased during in vitro MSCs chondrogenic differentiation. Conversely, in 2 years old zebrafish, high levels of p-ERK and low levels of aggrecan, a chondrogenic maturation marker, suggested a reduced chondrogenic commitment. Upon IL-1β treatment, miR-204 and SOX9 expression decreased in MSCs and mature chondrocytes. Interestingly, the addition of MSM reversed IL-1β effects in both cell types by increasing miR-204, SOX9, SESN1 and COMP expression. MSM promoted chondrogenesis in both adult zebrafish and larvae. Moreover, MSM stimulated osteoblasts maturation in vitro and osteogenesis in vivo, as shown by the more intense calcein and Alizarin Red (AR) staining in MSM-treated adult zebrafish and larvae compared to untreated. Interestingly, p-ERK levels were lower in the fins and scales of MSM-treated zebrafish compared to untreated. Fisetin supplementation promoted MSCs osteogenic differentiation in vitro. Moreover, fisetin stimulated bone formation and mineralization in vivo, as shown by the higher AR and calcein staining in fisetin-treated adult zebrafish and larvae compared to untreated. Remarkably, fisetin significantly enhanced osteogenic maturation in primary fibroblasts of patients with Cleidocranial Dysplasia, a genetic skeletal disease caused by RUNX2 mutations. A delivery system with PLGA (poly lactic-co-glycolic acid) nanoparticles was generated to encapsulate fisetin [PLGA-(Fis)]. Surprisingly, PLGA nanoparticles improved fisetin stability and its biological effects on gene expression. Moreover, in a microfluidic organ-on-a-chip experiment, PLGA-(Fis) nanoparticles showed the ability to cross the human intestinal epithelial tissue, preventing fisetin degradation. In conclusion, this study shows that miR-204 negatively regulates the MSCs’ commitment to the osteochondrogenic lineage, while it positively influences the maturation of chondroblasts and osteoblasts. Moreover, our data show that MSM and fisetin act by influencing MSC commitment and differentiation and have beneficial effects on osteogenesis, suggesting that patients affected by skeletal degenerative diseases of both genetic and metabolic origins may benefit from their administration.

Nelle malattie associate all'invecchiamento, come l'osteoporosi e l'artrosi, la cartilagine e l'osso sono i tessuti più comunemente danneggiati. I condrociti e gli osteociti originano da cellule staminali mesenchimali pluripotenti (MSCs) attraverso il differenziamento condrogenico e osteogenico; due processi correlati. RUNX2 e SOX9 sono i principali fattori di trascrizione per l’osteogenesi e la condrogenesi, rispettivamente. Essi interagiscono direttamente e possono inibire reciprocamente la loro attivazione. La regolazione epigenetica mediata dai miRNA influenza notevolmente la direzione del differenziamento delle MSCs. È stato scoperto che il miR-204 ha come bersaglio molecolare l’mRNA di RUNX2 e che la sua espressione è promossa da SOX9. È risaputo che lo stato di infiammazione altera il differenziamento condrogenico e osteogenico delle MSCs. Il metilsulfonilmetano (MSM) e la fisetina, due composti nutraceutici con proprietà anti-infiammatorie e antiossidanti, sono efficaci nella gestione terapeutica delle malattie degenerative della cartilagine e dell'osso. In questo studio, abbiamo delucidato il ruolo del miR-204 durante il commissionamento e il differenziamento delle MSCs e analizzato gli effetti complessivi dell’MSM e della fisetina sulla condrogenesi e osteogenesi. Le analisi sperimentali sono state condotte sia in vitro che in vivo. Il silenziamento dell’attività del miR-204 nelle MSCs aumentava l’espressione di geni associati alla maturazione condrogenica (SOX9, COMP, COL2A1) e osteogenica (COL1A1) durante la fase iniziale del differenziamento delle MSCs. Al contrario, l’assenza di attività del miR-204 influenzava notevolmente la maturazione dei condroblasti e degli osteoblasti durante la fase tardiva del differenziamento. L’espressione di RUNX2 risultava leggermente alterata rispetto al controllo, mentre il livello di espressione della proteina aumentava nelle cellule in cui il miR-204 era silenziato. In vivo, l’espressione del miR-204 aumentava durante lo sviluppo larvale degli zebrafish e fino a 6 mesi di età, per poi diminuire quando gli zebrafish anziani. È interessante notare come i livelli di espressione della proteina -catenina e di p-ERK diminuivano durante il differenziamento condrogenico delle MSCs, mentre invece negli zebrafish aventi 2 anni di età alti livelli di p-ERK e bassi livelli di aggrecano, un marcatore di maturazione condrogenica, suggerivano un ridotto processo di condrogenesi. In seguito a trattamento con IL-1, l’espressione del miR-204 e di SOX9 diminuiva sia nelle MSCs che nei condrociti maturi. È interessante notare come l’aggiunta dell’MSM abbia annullato gli effetti negativi dell’IL-1 in entrambi i tipi cellulari aumentando l’espressione di miR-204, SOX9, SESN1 e COMP. L’MSM promuoveva la condrogenesi sia nelle larve che negli zebrafish adulti. Inoltre, l’MSM stimolava la maturazione degli osteoblasti in vitro e l’osteogenesi in vivo, come dimostrato dalla maggiore intensità della colorazione con calceina e Alizarin Red (AR) negli zebrafish adulti e nelle larve trattate con MSM rispetto ai non trattati. Inoltre i livelli di p-ERK erano più bassi nelle pinne e nelle squame degli zebrafish trattati con MSM rispetto ai non trattati. Il trattamento con fisetina promuoveva il differenziamento osteogenico delle MSCs. Inoltre, la fisetina favoriva la formazione e la mineralizzazione dell’osso in vivo, come evidenziato dalla maggiore intensità della colorazione con calceina e AR negli zebrafish adulti e nelle larve trattate con fisetina rispetto ai non trattati. Sorprendentemente, la fisetina aumentava sensibilmente la maturazione osteogenica di fibroblasti primari isolati da pazienti affetti da Displasia Cleidocranica, una malattia genetica dello sviluppo osseo causata da mutazioni nel gene RUNX2. Abbiamo generato delle nanoparticelle costituite da acido lattico e glicolico (PLGA) con incapsulata la fisetina PLGA-(Fis). Sorprendentemente, le nanoparticelle PLGA hanno migliorato la stabilità della fisetina, amplificando i suoi effetti sull’espressione genica. Inoltre, mediante un esperimento di microfluidica organ-on-a-chip, abbiamo dimostrato come PLGA-(Fis) erano in grado di attraversare l’epitelio intestinale umano preservando la fisetina dalla degradazione. In conclusione, questo studio evidenzia come il miR-204 regola negativamente il commissionamento osteo-condrogenico delle MSCs, mentre regola positivamente la maturazione dei condroblasti e degli osteoblasti. Inoltre, i dati sperimentali dimostrano come l’MSM e la fisetina agiscano influenzando il commissionamento e il differenziamento delle MSCs e hanno effetti positivi sull’osteogenesi, suggerendo che pazienti affetti da malattie scheletriche sia di origine genetica che metabolica possono trarre beneficio dalla loro somministrazione.