Biomedical approaches in regenerative medicine: a new algorithm for tissue engineering and regenerative medicine

The inability to self-repair/self-regenerate has been a growing medical issue, as accidents provoke significant injuries. To overcome this inconvenience, Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM) has emerged as a multidisciplinary field that combines engineering futures with biological elements such as cells and growth factors. The usual approach of TERM has been using specific platforms made of biocompatible materials with the ability to mimic the microenvironment surrounding the cell. Notwithstanding, this system focused on finding the perfect result to “fill in” the area of damaged tissue with poor consideration of the biological pathways for self-healing. This thesis proposes a novel methodological algorithm, henceforth named Regenerative Algorithm. In this regard, it is proposed a three-step process that considers the main stages of the self-healing mechanisms of the human body. This thesis is divided into four main chapters; each one shows a case study related to each of the steps proposed in the Regenerative Algorithm. Chapter 1 presents a validation study of a novel collagenase extracted from the anaerobic bacterial culture of Vibrio alginolyticus. In clinical practice, collagenases are used in the treatment of damaged tissue as a debriding instrument, which is related to the first part of the algorithm, which is the destructuring of the tissue. The results indicate that there is high potential for using the novel collagenase in clinical practice, given its efficacy on stem cell extraction without affecting cellular integrity. Chapter 2 displays an in vitro and in vivo evaluation of decellularized collagen membranes as one approach for the second step of the algorithm, which involves the recreation of the tissue structure with external materials to support the regeneration process. There are diverse methods to accomplish the second stage according to the degree of damage, in this chapter it is presented an invasive method using a 3D scaffold for the specific treatment of capsular contracture formation during breast reconstruction. The results showed that the physicochemical characteristics of the membranes influence the differentiation capacities of cells and tissue stimulation, affecting the development of well-organized adipose tissue. Chapter 3, on the other hand, presents a non-invasive method for the second step of the algorithm by studying an injectable Low Molecular Weight Hyaluronic Acid (LMW-HA) in a case study of aberrant scar treatment. It seems that lower concentrations of HA slowly stimulate cellular processes while higher concentrations saturate the cells reducing their activation. Moreover, in the clinical study, the patients treated with HA presented a more structured and smoother tissue, which means that the use of HA may increase the total recovery of the tissue. Chapter 4 exposes a study of validation of a device that introduces the last stage of the algorithm, which is the use of cellular elements that enhance the regeneration process of the tissue. This chapter presents the characterization of the product obtained after processing fat tissue with a novel Nanofat system. The results demonstrated that the product could differentiate into the three mesodermal lineages, and more importantly, the immunophenotyping analysis revealed the presence of pluripotent stem cells. Moreover, the main secretome of the product presents proliferative, pro-angiogenic, pro-differentiative and pro-antiapoptotic factors, which are vital in the regenerative process. According to the results obtained with each approach, following the proposed Regenerative Algorithm, the regenerative process of damaged tissue can be significantly improved.

L'incapacità di auto-ripararsi/auto-rigenerarsi è stato un problema medico crescente, poiché gli incidenti provocano lesioni significative. Per superare questo inconveniente, l'ingegneria dei tessuti e la medicina rigenerativa (TERM) è emersa come un campo multidisciplinare che combina il futuro dell'ingegneria con elementi biologici come cellule e fattori di crescita. L'approccio abituale di TERM ha utilizzato piattaforme specifiche realizzate con materiali biocompatibili con la capacità di imitare il microambiente che circonda la cellula. Nonostante ciò, questo sistema si è concentrato sulla ricerca del risultato perfetto per "riempire" l'area del tessuto danneggiato con scarsa considerazione dei percorsi biologici per l'autoguarigione. Questa tesi propone un nuovo algoritmo metodologico, d'ora in poi chiamato Algoritmo Rigenerativo. A tal proposito si propone un percorso in tre fasi che considera le fasi principali dei meccanismi di autoguarigione del corpo umano. Questa tesi è suddivisa in quattro capitoli principali; ognuno mostra un caso di studio relativo a ciascuno dei passaggi proposti nell'Algoritmo Rigenerativo. Il capitolo 1 presenta uno studio di validazione di una nuova collagenasi estratta dalla coltura batterica anaerobica di Vibrio alginolyticus. Nella pratica clinica, le collagenasi sono utilizzate nel trattamento del tessuto danneggiato come strumento di sbrigliamento, che è correlato alla prima parte dell'algoritmo, che è la destrutturazione del tessuto. I risultati indicano che esiste un alto potenziale per l'utilizzo della nuova collagenasi nella pratica clinica, data la sua efficacia nell'estrazione di cellule staminali senza compromettere l'integrità cellulare. Il capitolo 2 mostra una valutazione in vitro e in vivo delle membrane di collagene decellularizzate come un approccio per la seconda fase dell'algoritmo, che prevede la ricreazione della struttura del tessuto con materiali esterni per supportare il processo di rigenerazione. Esistono diversi metodi per realizzare la seconda fase in base al grado di danno, in questo capitolo viene presentato un metodo invasivo che utilizza uno scaffold 3D per il trattamento specifico della formazione di contratture capsulari durante la ricostruzione del seno. I risultati hanno mostrato che le caratteristiche fisico-chimiche delle membrane influenzano le capacità di differenziazione delle cellule e la stimolazione dei tessuti, influenzando lo sviluppo del tessuto adiposo ben organizzato. Il capitolo 3, invece, presenta un metodo non invasivo per la seconda fase dell'algoritmo studiando un acido ialuronico a basso peso molecolare iniettabile (LMW-HA) in un caso studio di trattamento di cicatrici aberranti. Sembra che concentrazioni più basse di HA stimolino lentamente i processi cellulari mentre concentrazioni più alte saturino le cellule riducendone l'attivazione. Inoltre, nello studio clinico, i pazienti trattati con HA presentavano un tessuto più strutturato e più liscio, il che significa che l'uso di HA può aumentare il recupero totale del tessuto. Il capitolo 4 espone uno studio di validazione di un dispositivo che introduce l'ultimo stadio dell'algoritmo, ovvero l'utilizzo di elementi cellulari che potenziano il processo di rigenerazione del tessuto. Questo capitolo presenta la caratterizzazione del prodotto ottenuto dopo la lavorazione del tessuto adiposo con un nuovo sistema. I risultati hanno dimostrato che il prodotto potrebbe differenziarsi nei tre linee mesodermiche e, cosa più importante, l'analisi di immunofenotipizzazione ha rivelato la presenza di cellule staminali pluripotenti. Inoltre, il secretoma principale del prodotto presenta fattori proliferativi, pro-angiogenici, pro-differenziativi e pro-antiapoptotici, vitali nel processo rigenerativo. Secondo i risultati ottenuti con ciascun approccio, seguendo l'Algoritmo Rigenerativo proposto, il processo rigenerativo del tessuto danneggiato può essere notevolmente migliorato.