Chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: similarities and differences from an integrated biological and clinical approach

Introduction. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) and mantle cell lymphoma (MCL) are incurable lymphoid malignancies with a highly heterogeneous clinical course. Along with their molecular heterogeneity, growing interest is emerging in CLL and MCL similarities. Although MCL is generally an aggressive disease, a subset of patients shows an indolent clinical course, recently described by the World Health Organization (WHO) has non-nodal or CLL-like MCL. The recognition of the numerous parallels between CLL and MCL - in particular the centrality of the B-cell receptor (BCR) signaling pathway - was the starting point of our research. Aims. To explore the mechanisms behind variability in BCR signaling capacity in MCL, as compared to CLL, and to unveil possible relationship with clinical outcome. Methods. We experimentally applied phospho-specific flow cytometry combined with fluorescent cell barcoding (FCB) to MCL cell lines and patients. Using this technique, we measured the phosphorylation status of nine BCR signaling phosphoproteins, namely pSYK, pLCK, pBTK, pPLCg2, pp38, pERK1/2, pAKT, pNF-kB p65, pSTAT5, in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 10 MCL patients collected at diagnosis. The phosphorylation status of signaling proteins was measured in the basal condition and following BCR stimulation with anti-IgG, anti-IgD, anti-IgM antibodies, or their combination. Fluorescence intensity values were expressed as inverse hyperbolic sine (arcsinh) and corrected for the autofluorescence signals. Responses to BCR stimulation were calculated relative to signals in the basal condition. Then, arcsinh transformed data were subjected to unsupervised hierarchical cluster analysis (HCA) within the MCL samples. Association between signaling-defined groups of patients and clinical parameters was performed using Fisher’s exact test. Finally, we made some explorative comparison between data obtained on MCL and 10 CLL patients. Results. In MCL patients, the analysis of signaling phosphoproteins in the basal condition revealed high levels of pBTK, pPLCg2, and pSTAT5, with no or very low basal levels of pSYK, pLCK, pAKT and pNF-kB p65. After BCR stimulation with anti-IgM, we showed an overall significant higher level of both BCR proximal (pSYK, pLCK, pBTK, pPLCg2) and more distal (pp38, pERK1/2, pAKT) signaling nodes compared to unstimulated, excepted for pNF-kB p65 and pSTAT5. In contrast, anti-IgG or anti-IgD stimulation did not induce phosphoproteins activation, except for pAKT, which was significantly activated after anti-IgG stimulation. Unsupervised HCA identified two main clusters of MCL patients: cluster 1 comprised samples with a lower signaling response, whereas cluster 2 included samples showing a higher signaling response. Remarkably, the BCR signaling-based clustering was significantly associated with clinical parameters including age, response to therapy, and early or late-POD (progression of disease). Finally, we demonstrated a clear clustering dividing CLL and MCL patients, thus confirming that this analysis was able to distinguish the two different patients’ populations. Conclusion. FCB and phospho-specific flow cytometry proved versatile and efficient and allowed us to obtain reproducible and significant results on patients’ samples. Signaling perturbations at the single cell level provided complementary information to the available biological and clinical information in MCL and CLL patients. This tool may be candidate to become a clinically useful prognostic/predictive test in the future, after it has been validated in independent series. Our results represent a premise for an integrated biological and clinical approach to CLL and MCL.

Introduzione. La leucemia linfatica cronica (CLL) e il linfoma a cellule del mantello (MCL) sono malattie linfoproliferative non guaribili con decorso clinico eterogeneo. Oltre al riconoscimento della loro eterogeneità molecolare, sta emergendo un crescente interesse per le somiglianze tra CLL e MCL. Sebbene il MCL sia una malattia aggressiva, un suo sottotipo presenta un decorso clinico indolente, ed è stato recentemente definito dalla World Health Organization (WHO) sottotipo non-nodal o CLL-like. Il riconoscimento dei parallelismi tra CLL e MCL - in particolare la centralità della via del B-cell receptor (BCR) - è stato il punto di partenza del nostro lavoro. Obiettivi. Indagare i meccanismi alla base della diversa attivazione della via del BCR nel MCL, rispetto alla CLL, e individuare relazioni con l’outcome clinico. Metodi. Abbiamo applicato la citometria a flusso fosfo-specifica combinata con il fluorescent cell barcoding (FCB) a linee cellulari di MCL e a cellule di pazienti affetti da MCL. Abbiamo misurato lo stato di fosforilazione di nove fosfoproteine della via del BCR, ossia pSYK, pLCK, pBTK, pPLCγ2, pp38, pERK1/2, pAKT, pNF-κB p65, pSTAT5, in cellule mononucleate di sangue periferico di 10 pazienti con MCL, raccolte alla diagnosi. Lo stato di fosforilazione delle proteine è stato misurato nella condizione basale e dopo stimolazione del BCR con anticorpi anti-IgG, anti-IgD, anti-IgM o la loro combinazione. I valori di intensità di fluorescenza sono stati espressi come inverse hyperbolic sine (arcsinh) e corretti per i segnali di autofluorescenza. Le risposte alla stimolazione del BCR sono state calcolate rispetto ai segnali nella condizione basale. I dati sono stati sottoposti a una unsupervised hierarchical cluster analysis (HCA) tra i campioni di MCL. L'associazione tra gruppi di pazienti individuati sulla base delle differenze nella via del BCR e parametri clinici è stata calcolata con il Fisher’s exact test. Infine, abbiamo effettuato un confronto esplorativo tra i dati ottenuti nei casi di MCL e quelli ottenuti in 10 pazienti con CLL. Risultati. Nei pazienti con MCL, l'analisi delle fosfoproteine nella condizione basale ha rivelato livelli elevati di pBTK, pPLCγ2 e pSTAT5, con livelli basali nulli o molto bassi di pSYK, pLCK, pAKT e pNF-κB p65. Dopo stimolazione del BCR con anti-IgM, abbiamo dimostrato un livello più elevato sia dei nodi prossimali (pSYK, pLCK, pBTK, pPLCγ2) sia di quelli più distali (pp38, pERK1/2, pAKT) rispetto al basale, ad eccezione di pNF-κB p65 e pSTAT5. Al contrario, la stimolazione con anti-IgG o anti-IgD non ha indotto l'attivazione delle fosfoproteine, ad eccezione di pAKT, che è risultata significativamente attivata dopo la stimolazione con anti-IgG. La unsupervised HCA ha identificato due gruppi di pazienti con MCL: il cluster 1 comprendeva campioni con una risposta di attivazione inferiore nella via del BCR, mentre il cluster 2 includeva campioni con una risposta più elevata. Il raggruppamento dei pazienti basato sul segnale del BCR è risultato significativamente associato ai parametri clinici quali età, risposta alla terapia e POD (progression of disease) precoce o tardiva. Infine, abbiamo dimostrato una netta divisione tra i pazienti affetti da CLL e MCL, confermando così che questa analisi è in grado di distinguere le due diverse popolazioni di pazienti. Conclusioni. FCB e citometria a flusso fosfo-specifica sono versatili ed efficienti e ci hanno permesso di ottenere risultati significativi sui campioni di pazienti. Le perturbazioni di segnale a livello di singola cellula hanno fornito informazioni complementari alle informazioni biologiche e cliniche disponibili per i pazienti con MCL e CLL. Questa metodica potrebbe diventare un test prognostico/predittivo clinicamente utile, dopo validazione in serie indipendenti di pazienti. I nostri risultati rappresentano una premessa per un approccio biologico e clinico integrato alla CLL e al MCL.