MOLECULAR MECHANISMS REGULATING BIOLOGICAL HETEROGENEITY IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA: FROM THE VARIABLE SIGNALING RESPONSE TO CD20 ANTIBODIES AND KINASE INHIBITORS TO THE DIFFERENTIAL EXPRESSION OF CATALASE

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most prevalent form of leukemia in Western countries with the highest incidence among adults. CLL remain an incurable disease characterized by an extremely variable clinical course and response to treatment. In the last decades, therapeutic CD20 monoclonal antibodies (mAbs) have represented one of the most important advances in the treatment of lymphoproliferative disorders, including CLL. CD20 mAbs are the most important promising therapeutic partners for inhibitors of BCR‐associated kinase (BAKi), however their biological activity remains elusive. To this aim, the purpose of my PhD research was to expand the knowledge of the biological basis of CD20 antibodies treatment. In this study, we showed that in leukemic cells from CLL patients the CD20 therapeutic antibodies, namely rituximab, ofatumumab, and obinutuzumab, inhibit BCR signaling pathways. Moreover, we showed that the combination of CD20 mAbs and BAKi enhanced the activity of the single agents in inducing cell death in CLL. Moreover, there is a growing interest in CLL cells’ metabolism and its role in the clinical course of the disease. In CLL, it has been recently identified a differential catalase (CAT) expression associated with divergent clinical behaviors and progression. A single nucleotide polymorphism (SNP) (rs1001179, CAT-262 C/T) in the catalase promoter has been demonstrated to alter catalase cellular expression. Moreover, epigenetic modifications, such as DNA methylation, contribute to the regulation of catalase expression in several biological contexts. However, the precise molecular mechanisms controlling catalase expression are still poorly understood. For this purpose, we aimed at investigating the mechanisms in regulating catalase expression in CLL patients. Therefore, we first confirmed that CLL patients express increased levels of catalase compared with healthy donors. Then, we investigated the involvement of genetic and epigenetic regulatory mechanisms in the differential catalase expression in CLL patients. Our data showed that the rs1001179 SNP, as well as methylation within the catalase promoter, play a role in the regulation of catalase gene expression in CLL cells. Taken together, these data indicate that a lower level of methylation in the catalase promoter may constitute a risk factor in CLL harboring the T allele. 4 In conclusion, the results of my PhD thesis for one side advances our understanding of mechanisms of action of CD20 mAbs as single agents or in combination with BAKi, thus informing on the potential of combined therapies in ongoing and future clinical trials in patients with CLL. On the other side, it provides new insights into the knowledge of genetic and epigenetic mechanisms regulating the catalase expression in CLL. Moreover, these data form the basis for future studies aimed at dissecting molecular mechanisms that regulate catalase expression, which could be of crucial relevance for the development of prognostic and therapeutic tools targeting redox pathways.

La leucemia linfocitaria cronica (LLC) è la forma di leucemia più diffusa nei paesi occidentali con la più alta incidenza tra gli adulti. La LLC rimane una malattia incurabile caratterizzata da un decorso clinico e una risposta al trattamento estremamente variabile. Negli ultimi decenni gli anticorpi monoclonali anti-CD20 (mAbs) hanno rappresentato uno dei progressi più importanti nel trattamento dei disturbi linfoproliferativi, tra cui la LLC. Gli anticorpi terapeutici anti-CD20 sono i più importanti e promettenti partner terapeutici per gli inibitori delle chinasi associate al recettore delle cellule B (BAKi), tuttavia la loro attività biologica rimane elusiva. A questo scopo, obiettivo dello studio è ampliare la conoscenza delle basi biologiche di risposta al trattamento con anticorpi anti-CD20. In questo studio abbiamo dimostrato che nelle cellule leucemiche dei pazienti affetti da LLC anticorpi terapeutici CD20, rituximab, ofatumumab e obinutuzumab, inibiscono la segnalazione del BCR. Abbiamo inoltre dimostrato che la combinazione di mAbs CD20 e BAKi determina un aumento della morte cellulare nella LLC. Secondo obiettivo dello studio è investigare il metabolismo delle cellule LLC e il suo ruolo nel decorso clinico della malattia. Nella LLC, è stata recentemente identificata un'espressione differenziale della catalasi (CAT) associata alla progressione e a comportamenti clinici divergenti. È stato dimostrato che un polimorfismo (SNP) (rs1001179, CAT-262 C/T) nel promotore della catalasi altera l'espressione cellulare di quest’ultima. Inoltre, le modifiche epigenetiche, come la metilazione del DNA, contribuiscono alla regolazione dell'espressione della catalasi in diversi contesti biologici. Tuttavia, gli effetti delle variazioni nella sequenza del promotore e dei livelli di metilazione che controllano l'espressione della catalasi sono ancora poco conosciuti. A questo scopo, abbiamo studiato i livelli di espressione della catalasi nei pazienti con LLC e in soggetti sani. Facendo seguito ad uno studio precedente, abbiamo confermato che i pazienti con LLC esprimono livelli di catalasi più elevati rispetto ai donatori sani. In seguito, abbiamo studiato il coinvolgimento dei polimorfismi e dei livelli di metilazione del promotore nell’ espressione differenziale della catalasi in pazienti con LLC. I nostri dati hanno mostrato che il polimorfismo rs1001179 e la metilazione a livello del promotore si associano a diversità significative nella regolazione dell'espressione del gene della 6 catalasi nelle cellule di LLC. L’analisi di questi dati suggerisce che un livello più basso di metilazione nel promotore della catalasi possa costituire un fattore di rischio nei pazienti con LLC che presentano la variante allelica T. In conclusione, i risultati della mia tesi di dottorato di ricerca per un lato contribuiscono all’avanzamento della comprensione dei meccanismi d'azione dei CD20 mAbs come agenti singoli o in combinazione con BAKi, a supporto dell’interpretazione degli effetti di potenziali terapie combinate in pazienti con LLC. Dall'altro lato, fornisce nuovi approfondimenti sul ruolo dei meccanismi genetici ed epigenetici che regolano l'espressione della catalasi nella LLC. Questi dati potranno costituire la base per studi futuri volti a definire i meccanismi molecolari che regolano l'espressione della catalasi e che potrebbero essere di importanza cruciale per lo sviluppo di strumenti prognostici e terapeutici mirati ai percorsi redox della cellula leucemica.