A multi-omics approach identifies the pivotal role of cardiolipin remodelling, alpha subunit of the mitochondrial trifunctional protein and long chain fatty acids in stem cells of pancreatic cancer

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) costituisce la settima causa di morte per cancro al mondo. Negli stadi iniziali, questa patologia è asintomatica e non presenta sintomi specifici, di conseguenza la diagnosi nei pazienti avviene prettamente quando il tumore non è resecabile per la presenza di metastasi. L’elevato tasso di mortalità associato al PDAC è in parte attribuito ad una sottopopolazione di cellule molto aggressive, note come cellule staminali tumorali del pancreas (PCSC). Sebbene sia noto che le PCSC siano associate a scarsi risultati nel trattamento chemioterapico dei pazienti, è ancora poco nota la regolazione sia delle vie di trasduzione del segnale che di quelle metaboliche. Una caratterizzazione molecolare completa della biologia delle PCSC è di fondamentale importanza per colpire il PDAC. Pertanto, l’obbiettivo principale di questa tesi di dottorato è stato caratterizzare approfonditamente queste cellule da un punto di vista molecolare per identificare disfunzioni cellulari, metaboliche e di segnalazione correlate alla fisiopatologia del PDAC, al fine di suggerire nuovi bersagli terapeutici. Il mio progetto di dottorato si è svolto presso il laboratorio di “Proteomica e spettrometria di massa” afferente al Dipartimento di Biotecnologie dell’Università degli studi di Verona sotto la guida della Prof.ssa Daniela Cecconi, ma anche in altri laboratori grazie alla consolidata rete di collaborazioni instaurate. La coltura delle linee cellulari PDAC è stata svolta presso il laboratorio diretto dalla Prof.ssa Marta Palimeri (presso il Dipartimento di Neuroscienze, Biomedicina e Movimento dell'Università degli studi di Verona); l’analisi proteomica è stata effettuata in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Emilio Marengo (presso il Dipartimento di Scienze e Innovazione Tecnologica, dell’Università degli studi del Piemonte Orientale); e l’analisi lipidomica è stata realizzata in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Michael Wakelam e della Dr.ssa Andrea F. Lopez- Clavijo presso l’istituto di ricerca Babraham di Cambridge (Regno Unito), dove ho svolto il mio tirocinio estero della durata di tre mesi. Durante questo progetto, sono state analizzate e confrontate tra loro le PCSC di quattro linee PDAC (ossia, PaCa3, PaCa44, MiaPaCa2 e PC1J) e le rispettive cellule parentali (P). Le cellule P sono state coltivate in un apposito terreno di coltura per l’ottenimento di PCSC. La morfologia delle cellule P e degli sferoidi tumorali PCSCs è stata esaminata tramite microscopia. Successivamente, è stata valutata l’espressione di geni e proteine correlate alla staminalità e alla quiescenza mediante analisi qPCR e di immunoblotting. In seguito, le possibili alterazioni nel proteoma e nel lipidoma delle PCSC sono state investigate con analisi proteomiche e lipidomiche. I dati “omici” sono stati poi approfonditi sia tramite analisi bioinformatiche, che con ulteriori saggi, tra i quali: il Western blot, la microscopia confocale a fluorescenza per rilevare le goccioline lipidiche, e un saggio enzimatico colorimetrico per valutare il contenuto di acidi grassi liberi. Dall’integrazione dei dati di proteomica e lipidomica sono emerse modulazioni comuni tra le PCSC e anche significative differenze rispetto alle cellule P. Tutte e quattro le PCSC hanno mostrato in comune la sottoregolazione sia della L-lattato deidrogenasi A (LDHA) che della sua forma fosforilata (p-LDHA), e la sovraregolazione della subunità alpha dell’enzima trifunzionale mitocondriale (HADHA), che è coinvolta nel rimodellamento della cardiolipina (CL). Inoltre, l’analisi bioinformatica ha evidenziato il coinvolgimento delle proteine sovraspresse nelle PCSC in alcune vie del metabolismo lipidico, quali ad esempio l’allungamento degli acidi grassi (FA) e la biosintesi degli FA insaturi. A supporto di questi risultati, l’analisi lipidomica ha indicato un aumento nei livelli di FA a catena lunga e molto lunga, prodotti dall’attività dell’elongasi-5 che è stato predetto come gene in comune delle PCSC delle linee PaCa3, PaCa44, MiaPaCa2 e PC1J. In accordo con la sovra-regolazione di HADHA, nelle PCSC è stato determinata l’induzione di specie molecolari di CL derivanti da incorporamento di catene aciliche 16:0, 18:1 e 18:2 miste. Inoltre, l’analisi lipidomica ha anche suggerito l’induzione del pathway degli fosfoinositidi nelle PCSC. Per concludere, i risultati ottenuti in questa tesi di dottorato evidenziano innanzitutto la potenzialità di un approccio multi-omico, e contribuiscono a migliorare la comprensione del metabolismo lipidico nelle PCSC. I dati ottenuti hanno suggerito l’importanza dell’allungamento degli FA, e per la prima volta hanno messo in rilievo il ruolo del rimodellamento della CL nelle PCSC. Complessivamente, questo studio potrà fornire preziose informazioni per lo sviluppo di nuove promettenti terapie contro il PDAC.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the seventh leading cause of cancer- related deaths worldwide. This pathology is asymptomatic at early stages and there are no specific symptoms, so patients are typically diagnosed when an unresectable tumour caused by the presence of metastases is shown. The high mortality rate of PDAC has also been attributable to the presence of a small subset of cells with very aggressive features called pancreatic cancer stem cells (PCSCs). Although PCSCs play a key role in driving patient poor outcomes and resistance to targeted therapies, little is known about the regulation of their signalling and metabolic pathways. A complete molecular characterization of PCSC biology is fundamental to make an impact on PDAC. Therefore, the aim of this PhD thesis was to obtain an in-depth characterization of PCSCs from a molecular point of view to detect cellular, metabolic and signalling dysfunctions implicated in pathophysiology of PDAC, possibly suggesting new therapeutic targets. My PhD project was carried out in the Proteomic and Mass Spectrometry Laboratory of Biotechnology Department at University of Verona under the guidance of Prof. Daniela Cecconi and in other laboratories thanks to established collaborations. PCSCs and PDAC cell cultures were obtained in collaboration with the research group of Prof. Marta Palmieri (Dept. of Neuroscience, Biomedicine and Movement of the University of Verona); proteomic analysis was done in collaboration with the research group of Prof. Emiliano Marengo (Dept. of Sciences and Technological Innovation, University of Eastern Piedmont); and lipidomic analysis was performed in collaboration with Prof. Michael J.O. Wakelam and Dr Andrea F. Lopez-Clavijo during my three-months placement abroad at the Lipidomics facility of the Babraham Institute in Cambridge (UK). During my PhD project, four PCSC lines (i.e., PaCa3, PaCa44, MiaPaCa2, and PC1J) and relative parental (P) cells were analysed and compared. The four P cell lines were cultured and used to obtain PCSCs. Morphological evaluation by microscopy of PCSC tumour spheres and their relative P cells was performed. Then, the expression of stem and quiescence related markers were investigated in PaCa3, PaCa44, MiaPaCa2, and PC1J CSCs by qPCR and immunoblotting analyses. Subsequently, proteomics and lipidomics analyses were performed to evaluate possible alterations in proteome and lipidome of PCSCs. Omics data were subjected to bioinformatic analysis and evaluated further in-depth by western blotting to confirm protein modulation, confocal fluorescence microscopy to detect lipid droplets, and colorimetric enzymatic kit to assess free fatty acid levels. The integration of proteomics and lipidomics data suggested that PCSCs displayed common modulations, while significant differences were detected compared to their counterpart. The downregulation of L-lactate dehydrogenase A chain (LDHA) and its phosphorylated form (p-LDHA), and the upregulation of the trifunctional enzyme subunit alpha (HADHA) involved in cardiolipin remodelling were in common among all four PCSC lines. Bioinformatic analysis also revealed that upregulated proteins of PCSCs were mainly involved in lipid-related pathways, such as fatty acid (FA) elongation and biosynthesis of unsaturated FAs. Lipidomics analysis supported these results, indicating an increase of long and very long FAs, which are products of fatty acid elongase-5 predicted as an active gene of PaCa3, PaCa44, MiaPaCa2, and PC1J CSCs. In accordance with HADHA upregulation, PCSCs were also characterized by the induction of molecular species of cardiolipin with mixed incorporation of 16:0, 18:1, and 18:2 acyl chains. In addition, lipidomic analysis also suggested the induction of phosphoinositide pathway in PCSCs. In conclusion, the results obtained in the present PhD thesis support the potential of a multi-omics approach and provide a better understanding of lipid metabolism in PCSCs. The findings obtained indicated the importance of FA elongation and highlight for the first time the involvement of cardiolipin remodelling in PCSCs. Altogether this study provides novel information for the development of promising new therapies against PDAC.