Identification and characterization of new plasmatic isoforms of the tumor suppressor gene PTPRG and development of new specific monoclonal antibodies

Obiettivi: 1) identificare la presenza e caratterizzare le diverse isoforme della proteina plasmatica di tipo recettore tirosin fosfatasi Gamma (PTPRG) 2) caratterizzazione di nuovi anticorpi monoclonali specifici per il dominio extracellulare della proteina. Background: PTPRG è un enzima ampiamente espresso, si ritrova principalmente espresso nel polmone, stomaco, esofago, colon, fegato, milza e reni. PTPRG mappa nel CHR 3p14.2/21 ed è stato implicato come candidato gene oncosoppressore. Sono state riportate perdita di eterozigosità, delezione genica, mutazione puntiforme e ipermetilazione del promotore. La maggior parte dei recettori intracellulari possiedono domini fosfatasici simili, mentre la porzione extracellulare delle fosfatasi mostra massima variazione strutturale. Per quel che riguarda PTPRG, nel cervello di ratto sono state riportate diverse isoforme, tra cui la sola regione extracellulare della proteina facendoci presupporre la possibilità che potesse esistere anche nell’uomo un'isoforma solubile. Una prima evidenza sperimentale dell’esistenza di questa possibile isoforma di PTPRG è già stata messa in luce nel nostro gruppo, in studi precedenti ,dove è stata evidenziata all'interno della colloide della tiroide. Tali presupposti ci hanno suggerito la possibilità che potesse esistere una forma solubile extracellulare di PTPRG anche all’interno di altri fluidi biologici. Metodi: immunoprecipitazione, western blotting, citometria a flusso. Risultati: Abbiamo identificato, nel plasma umano e murino, diverse nuove isoforme di PTPRG, una delle quali caratterizzata in precedenza tramite clonazione solo nel ratto. I polipeptidi identificati hanno un peso molecolare apparente di circa 120 kDa (banda principale) e di 90 kDa (banda minore) rispettivamente. Sorprendentemente, anche la proteina di lunghezza intera, che include la regione transmembrana, è stata identificata nel siero, anche se dopo ultracentrifugazione a 100000 × g, risulta precipitare in forma di soluto suggerendo la presenza di un modulo associato a vescicole di tipo esosomiale. La banda maggiore (120 kDa) è stata individuata nel fegato di topo (isolato dopo perfusione in soluzione salina in modo da eliminare eventuali tracce di plasma) e in terreno condizionato senza siero derivato da HepG2, una linea cellulare di carcinoma hepato-cellulare comunemente utilizzata per lo studio della regolamentazione della sintesi proteica epatica. L’ isoforma da 120 kDa risulta essere up-regolata dopo trattamento con etanolo e potassio dicromato, due composti noti per essere citotossici per il fegato. Con l'obiettivo futuro di creare un saggio ELISA per lo screening rapido dell’ espressione di PTPRG solubile in varie condizioni fisiopatologiche, abbiamo sviluppato e caratterizzato in seguito, due nuovi anticorpi monoclonali che riconoscono un’epitopo nel dominio extracellulare del PTPRG. Conclusione: Abbiamo descritto per la prima volta nell'uomo e nel topo la presenza diverse isoforme solubili di PTPRG all’interno del plasma che sembrano essere rilasciate principalmente dal fegato. La banda più importante di kDa 120 sembra essere glicosilata e la sua espressione è modulata da stimoli noti per la produzione di danno epatico. La produzione e la caratterizzazione di nuovi anticorpi monoclonali in grado di riconoscere specificamente questa proteina qui descritta consentiranno la messa a punto di nuovi test immunologici e apriranno la strada ad una migliore caratterizzazione di questa proteina e del suo ruolo nella salute e nella malattia.

Aims: 1) Identify the presence and characterize the plasmatic isoforms of Receptor Type Protein Tyrosine Phosphatase Gamma (PTPRG) 2) Characterization of new monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of the protein. Background: PTPRG is a broadly expressed enzyme mainly expressed in lung, stomach, esophagus, colon, liver, spleen and kidney. PTPRG maps to chr 3p14.2/21 and has been implicated as a candidate tumor suppressor gene. Loss of eterozigosity, gene deletion, point mutation and promoter hypermethylation has been reported. The majority of the receptor PTP share similar intracellular domains while the extracellular portion exhibits broad structural variation. Rat brain has been reported to express various PTPRG isoforms, including the isolated extracellular region 1. Previous work from our group suggested the production on an extracellular soluble form of PTPRG in thyroid. Methods: immunoprecipitation, western blotting, flow cytometry. Results: We have identified, in human and murine plasma, new PTPRG isoforms, one of which previously characterized by cDNA cloning only in rat . The polypeptides identified have an apparent MW of about 120 kDa (major band) and 90 kDa (minor band) respectively. Surprisingly, also the full length protein, that include a transmembrane region, was identified in the serum and was present in the fraction precipitating at 100000 ×g, suggesting the presence of an exosome-associated form. The major band (120 kDa) was also identified in mouse liver (isolated after saline perfusion in order to remove plasma) and in serum-free conditioned medium derived from HepG2, an hepatocellular carcinoma cell line commonly used for the study of the regulation of hepatic protein synthesis. The 120 kDa isoform was up-regulated by treatment with ethanol and potassium dichromate, two compounds known to be cytotoxic for liver. With the future goal to set up an ELISA-based assay for the rapid screening of soluble PTPRG expression in various physiopathological conditions, we have developed and characterized two new monoclonal antibodies raised against the extracellular domain of PTPRG expressed in eukariotic cells (HEK 293F). Conclusion: We have described for the first time in human and mouse the presence of soluble, plasmatic forms of PTPRG that appear to be released primarily by liver. The major 120 kDa band appear to be glycosylated and its expression is modulated by stimuli known to produce liver injury. The production and initial characterization of new monoclonal antibodies capable to specifically recognize this protein here described will permit the set up of new immunoassays and will pave the way to a better characterization of this proteins and its role in health and disease.