Development of three-dimensional models for the study of the hematopoietic stem cell niche

La maggior parte delle informazioni sulle principali proprietà delle cellule staminali ematopoietiche (HSCs), quali la capacità di auto-mantentenimento e di differenziazione multilineare, sono state acquisite mediante l’impiego dei tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale in vitro o dei modelli animali. Attraverso tali approcci sono stati raggiunti importanti avanzamenti nella conoscenza dei meccanismi che regolano lo sviluppo ed il mantenimento dell’emopoiesi. Nonostante ciò, nessuno dei sistemi di coltura a tutt’oggi descritti è in grado di mantenere in vitro l’emopoiesi a lungo termine, mentre i modelli animali non sempre riproducono adeguatamente le caratteristiche delle patologie onco-ematologiche umane. Recentemente sono stati sperimentati diversi sistemi artificiali tridimensionali (3D) per espandere i progenitori ematopoietici e per ottenere la differenziazione multilineare. Lo scopo principale del nostro studio ha consistito nello sviluppo di un nuovo modello 3D che, mediante l’impiego di materiali naturali, permettesse di riprodurre in vitro il più fedelmente possibile il microambiente midollare e la struttura delle nicchie che regolano il mantenimento delle HSCs. A tal fine sono stati impiegati come supporto la matrice ossea inorganica e le cellule staminali mesenchimali (MSCs) di derivazione umana per ricostituire in 3D il microambiente stromale su cui effettuare la cultura delle CD34+ HSCs. Sono state analizzate tre diverse condizioni di differenziamento volte ad ottenere i principali elementi cellulari del midollo osseo e della nicchia staminale: osteoblasti, adipociti e cellule endoteliali. Dopo due settimane di coltura delle CD34+ HSCs nei sistemi 3D ottenuti con le tre diverse condizioni di differenziamento, sono stati effettuati saggi immunoistochimici volti ad identificare l’attecchimento e lo sviluppo/differenziazione di cloni di cellule ematopoietiche e saggi clonogenici (CFC- ed LTC-IC) per la valutazione del mantenimento di precursori immaturi. Tra i diversi stimoli differenziativi considerati, l’esposizione delle MSCs cresciute sui supporti ossei alle condizioni angiogeniche in presenza di placental derived growth factor (PlGF) ha reso possibile la riproduzione di alcune delle proprietà che rendono il microambiente stromale capace di sostenere l’emopoiesi. In base ai risultati dell’analisi immunoistochimica, le CD34+ HSCs cresciute in questi sistemi sono in grado di differenziarsi in elementi mieloidi CD45+/CD33+ e di mantenere una parte di esse nello stato non differenziato, come ulteriormente mostrato dai saggi CFC e LTC-IC. L’analisi di espressione genica, condotta sugli mRNA estratti dai campioni ottenuti con lo stimolo angiogenico (PlGF) e bloccati al momento della semina delle CD34+ HSCs, ha escluso nelle MSCs il differenziamento in senso endoteliale e miogenico. Piuttosto, l’incremento nell’espressione di alcuni dei marcatori delle fasi precoci di differenziamento osteoblastico e dell’angiopoietina 1 (ANGPT-1), una delle molecole chiave coinvolte nel mantenimento della nicchia staminale midollare, suggerisce l’acquisizione di un fenotipo e funzionalità propri di quei progenitori osteoblastici che supportano le HSCs. In conclusione, il modello 3D proposto in questo lavoro, basato sull’impiego delle MSCs e di un supporto naturale quale l’osso trabecolare, è in grado di sostenere la sopravvivenza e differenziazione delle HSCs attraverso una probabile creazione della nicchia osteoblastica. Sebbene siano necessari un ulteriore perfezionamento e standardizzazione e una caratterizzazione più ampia dei meccanismi che sostengono il mantenimento, l’espansione e la differenziazione delle HSCs, questo nuovo strumento può rappresentare un nuovo approccio per la riproduzione ex-vivo della nicchia midollare e per lo studio dell’ematopoiesi midollare in condizioni fisiologiche e patologiche.

Most information about hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal and multilineage commitment derives from standard bi-dimensional (2D) cell cultures or animal model systems. Through these approaches many important improvements in the understanding of the haematopoietic development have been achieved. However, none of the in vitro systems is capable of sustaining the haematopoiesis for a long time, whereas animal models may not adequately reproduce the features of human pathological conditions. Recently, several experiments using three-dimensional (3D) artificial systems have been carried out to expand haematopoietic progenitors and to achieve multilineage haematopoietic differentiation. The main aim of our study was to develop a new in vitro three-dimensional (3D) model of BM by employing natural components, to reproduce as close as possible BM microenvironment and the structure of HSC niches. To this aim, we employed human bone mineral matrix as scaffold and mesenchymal stem cells (MSCs) to reproduce the stromal microenvironment. Three different culture conditions were compared, aimed to achieve osteoblast, adipocyte and endothelial differentiation, respectively. After 2 weeks of CD34+ cell culture in the 3D system, immunohistochemistry as well as CFC and LTC-IC assays were carried out to investigate the system ability to maintain and differentiate HSCs. The exposure of MSCs to angiogenic stimuli in the presence of placental derived growth factor (PlGF) could reproduce, at least in part, the properties that make the microenvironment capable of supporting haematopoiesis. CD34+ cells grown in this 3D system differentiated into myeloid cells (CD45+/CD33+), but some of them remained in an undifferentiated status, as shown by the presence of CFC and LTC-IC after the culture. Immunohistochemical and gene expression analysis, carried out on the 3D system upon the angiogenic conditions before CD34+ cell culture, excluded the acquisition by MSCs of the endothelial-like phenotype, as well as the vascular smooth muscle cell differentiation. Instead, quite unexpectedly, the up-regulation of some of the early osteoblastic markers, together with angiopoietin 1 (ANGPT-1), suggested that the angiogenic conditions could have induced the differentiation of MSCs into HSC-supporting osteoblastic progenitors. In conclusion, our findings suggest that this new 3D model, based on the employment of MSCs and a natural scaffold of trabecular bone, is capable of inducing survival and differentiation of HSCs, probably through the creation of a osteoblastic-like HSC niche. Although further improvements, standardization processes, and mechanism evaluation are needed, this new tool may be useful to reproduce in vitro the conditions for HSC maintenance, expansion and differentiation, thus permitting to study the mechanisms of BM haematopoiesis in normal conditions and in haematological diseases.