DEVELOPMENT OF ANALYTICAL PROCEDURES FOR SCREENING AND QUANTIFICATION OF PSYCHOACTIVE SUBSTANCES IN DIFFERENT BIOLOGICAL MATRICES AND THEIR APPLICATION IN FORENSIC TOXICOLOGY

Le indagini post mortem e i performance test nel vivente sono le principali applicazioni della tossicologia forense. Assoluta specificità ed elevate accuratezza e precisione sono necessarie durante l’esecuzione delle analisi chimico-tossicologiche per garantire l’attendibilità degli esiti. Recentemente la cromatografia liquida ad alta pressione accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è diventata una tecnica utile per la ricerca e il dosaggio di veleni organici non volatili in diverse matrici biologiche. La LC-MS/MS consente lo sviluppo di analisi per lo screening mirato e il dosaggio di gruppi di sostanze, incluse molecole termolabili e/o non volatili, con elevata sensibilità e specificità d’analisi.Il progetto presentato è incentrato sullo sviluppo e sulla validazione di metodiche LC-MS/MS per la ricerca e il dosaggio di sostanze psicoattive ai fini delle indagini post mortem, e di cannabinoidi per le analisi su vivente. Lo scopo di questa tesi è stato: a) caratterizzare le molecole oggetto di studio dal punto di vista cromatografico e della spettrometria di massa; b) ottimizzare le procedure di isolamento delle medesime da diverse matrici biologiche; c) validare in modo completo tutte le metodiche LC-MS/MS sviluppate; d) applicare i metodi proposti all’analisi di campioni reali ed infine e) elaborare ed interpretare i risultati ottenuti.I risultati ottenuti hanno documentato l’efficacia della LC-MS/MS per lo screening di veleni organici non volatili con finalità forensi. In particolare, per le indagini post mortem, ci si è soffermati sui farmaci antidepressivi, antipsicotici e sedativo/ipnotici sviluppando due metodiche per la ricerca e il dosaggio di 88 principi attivi e metaboliti, in sangue cadaverico o in capello. Entrambe le metodiche sono state validate secondo le linee guida internazionali. L’analisi LC-MS/MS, applicata a campioni di sangue cadaverico, ha dimostrato grande valenza in termini di sensibilità e specificità per le molecole considerate, sia a fini di screening che per la conferma dei risultati ottenuti mediante analisi GC-MS. Questa metodica, inoltre, consente di ricercare direttamente e dosare i composti termolabili o non volatili come dimostrato in un caso di intossicazione fatale da duloxetina. Successivamente la LC-MS/MS è stata indirizzata alla ricerca e al dosaggio delle medesime sostanze nel capello e applicata all’analisi di campioni autoptici o di pazienti in terapia. L’analisi LC-MS/MS ha dimostrato la propria validità nell’identificazione dei composti psicoattivi considerati, anche quando presenti in concentrazioni limitate. Inoltre, l’alta sensibilità della LC-MS/MS, combinata con l’analisi segmentale del capello, consente di ottenere utili informazioni sull’iter terapeutico e la storia del consumo di dette sostanze, come evidenziato nel caso di un paziente che aveva sospeso e poi modificato la terapia farmacologica, confermando così l’anamnesi.Infine la LC-MS/MS è stata applicata alla ricerca di cannabinoidi in urina, il campione biologico di maggior utilizzo nella tossicologia forense su vivente. È stata sviluppata e completamente validata una metodica per la ricerca e il dosaggio di cannabinoidi e loro metaboliti in urine sottoposte ad idrolisi enzimatica; questa procedura comprende molecole non ricercate di routine quali il cannabigerolo, la ∆9-tetraidrocannabivarina (THCV) ed il suo metabolita 11-nor-9-carbossi-THCV. La procedura di estrazione dei cannabinoidi è stata sviluppata utilizzando DPX tips e una stazione robotica automatizzata per ridurre i tempi di processamento ed aumentare la produttività e la riproducibilità. La metodica LC-MS/MS è stata completamente validata secondo le linee guida SWGTOX. La procedura sarà utilizzata per la ricerca di nuovi indicatori urinari che permettano di individuare un consumo recente di cannabis o di discriminare tra utilizzatori occasionali e cronici o tra consumatori di cannabis e consumatori di THC sintetico.

The forensic toxicology field encompasses several applications, including post mortem and human performance testing, which may have administrative and/or medicolegal consequences and so require accurate and reliable toxicological analysis. Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) techniques became increasingly important for identification and quantification purposes. LC-MS/MS methods are target screening analysis for molecules with similar pharmacological activity or chemical structure, including thermolabile and non-volatile compounds, achieving high sensibility and specificity. This thesis project focused on the development and validation of LC-MS/MS methods for the detection of psychoactive substances in post mortem investigation and for the quantification of drugs of abuse, especially cannabinoids, in living subjects. Aims of this thesis were: a) the chromatographic and mass spectrometric characterization of the molecules of interest; b) the optimization of the extraction procedures from different biological matrices; c) the full validation of the LC-MS/MS methods developed d) the application to real cases and e) the interpretation of the results.The results obtained proved that LC-MS/MS technique performs reliable and sensitive analysis when used for screening of group of compounds with similar chemical structure or pharmacological activity. During this thesis project, we focused on antidepressants, antipsychotics and benzodiazepines analysis for post mortem investigations. LC-MS/MS target screening methods were developed to identify and quantitate 88 psychoactive substances and metabolites in post mortem blood or hair; both LC-MS/MS methods were fully validated accordingly to international guidelines. The LC-MS/MS analysis, applied to post mortem blood samples, proved to be an accurate and reliable confirmatory method compared to the GC-MS analysis routinely performed and to generally achieve higher sensibility and specificity. This target screening enables the direct identification and quantification of thermolabile and non-volatile compounds as demonstrated in a case of fatal intoxication by duloxetine. An LC-MS/MS method for hair testing was developed and applied to samples form autopsy cases or patients under treatment; the LC-MS/MS method demonstrated to be reliable and accurate in the detection of the psychoactive substances considered, even at very low concentrations. Furthermore, the possibility to perform segmental analysis of hair samples, combined to the high sensibility of the LC-MS/MS technique enable to obtain reliable chronological insight in the medical history of a subject as happened for one of the patient under treatment. The LC-MS/MS analysis fully confirmed the reported drug administration scheme and demonstrated not only the change in therapy but even the suspension period occurred in between.The second part of this project focused on the detection of cannabinoids in urine, which has several forensic applications such as antidoping control, driving under the influence of drugs or workplace drug testing. A LC-MS/MS method for screening and quantification of cannabinoids and metabolites in hydrolyzed urine was fully developed and validated; the screening procedure included molecules not routinely detected in urine, such as cannabigerol, ∆9-tetrahydrocannabivarin and its metabolite 11-nor-9-carboxy-∆9-tetrahydrocannabivarin. Enzymatic hydrolysis with Recombinant E. coli β-glucuronidase was optimized using authentic pooled urine samples collected during a controlled cannabis smoking clinical trial. The extraction procedure was developed using DPX tips and an automated liquid-handling system to reduce processing time and increase reproducibility and throughput of sample preparation. The LC-MS/MS method was fully validated accordingly to SWGTOX guidelines. This method will be applied to search for new urinary markers of recent cannabis intake or chronic frequent smoking habits.