Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ROLE IN ENDOTHELIAL DYSFUNCTION MECHANISMS AND ARTERIAL PRESSURE CONTROL

Lo scopo principale della tesi è valutare l’effetto del Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) e di alcune sostante e/o farmaci, che interagiscono sulla via di segnale cellulare da esso attivato (ossido nitrico dipendente), sulla funzione vascolare e in particolare sull’endotelio, sul microcircolo e sull’elasticità arteriosa. Inoltre intendiamo esplorare l’eventuale ruolo del VEGF nello sviluppo di disfunzione endoteliale, danno del microcircolo o dei grossi vasi potenzialmente implicati nell’insorgenza dell’ipertensione arteriosa. La tesi è stata suddivisa in 3 studi:1) scopo del primo studio: è dunque valutare il ruolo di alcuni componenti (licopene e TCMPs) contenuti nel frutto del pomodoro sulle cellule endoteliali. L’obiettivo primario del presente studio è valutare in cellule HUVEC i potenziali effetti di queste due componenti del pomodoro, in particolare considerare i loro effetti sulla sintesi di NO da cui dipende sia la funzione endoteliale che l’angiogenesi.Materiali e metodi. HUVECs incubate con licopene, TCMPs ed altre sostanze note quali VEGF e L-NAME sono state osservate al microscopio confocale valutando l’NO in termini d’intensità di fluorescenza. Risultati. Il licopene ha mostrato di modulare positivamente la produzione di NO intracellulare, mentre le TCMPs hanno mostrato un effetto inibitorio sia da sole che quando associate a stimolo con VEGF.Conclusioni. Lo studio evidenzia che i componenti del pomodoro hanno proprietà biologiche importanti, il licopene preserverebbe la funzione endoteliale mentre le TCMPs attenuerebbero una tappa critica dell’angiogenesi.2)copo della tesi era valutare l’effetto sulla funzione vascolare della salsa di pomodoro (80 grammi al giorno per sette giorni) confrontata con una dieta priva di pomodoro in volontari sani prima e dopo il consumo di un pasto ricco di grassi accompagnato o meno da ulteriori 80 grammi di salsa di pomodoro. Lo studio presenta un disegno a cross-over con un periodo di wash out di almeno 4 settimane tra le due fasi. I test vascolari a cui abbiamo sottoposto i pazienti sono stati: (i) la funzione endoteliale mediata da flusso (FMD) mediante metodica ecografica; (ii) lo “stiffness index” (SI) ed il reflection index (RI) mediante tecnica fortopletismografica; (iii) la distensibilità e la compliance carotidee mediante un sistema ecografico. Abbiamo incluso 19 maschi sani di età compresa tra 21 e 32 anni. Tutte le misure vascolari effettuate al basale nella prima giornata di studio non sono risultate significativamente diverse nei soggetti a seconda che avessero assunto o meno il pomodoro nella settimana precedente. Dopo il pasto grasso invece tutti i soggetti indipendentemente dall’assunzione o meno del pomodoro hanno mostrato una riduzione del RI (61,95 ± 9,18 % rispetto a 73,45 ± 10,05 % nei soggetti che avevano assunto il pomodoro; 64,83 ± 9,70 % rispetto a 70,73 ± 10,19 % nei soggetti che non avevano assunto pomodoro; P<0.001), indice di relativa vasodilatazione. Inoltre, solo i soggetti che avevano assunto pomodoro hanno mostrato rispetto al basale un incremento del diametro dell’arteria brachiale (4,25 ± 0,45 mm rispetto a 4,08 ± 0,39 mm, P<0.05), una riduzione della pressione diastolica (69,79 ± 7,28 mmHg rispetto a 73,07 ± 6,63 mmHg, P<0.05) ed un incremento della frequenza cardiaca (65,21 ± 8,41 bpm rispetto a 61,68 ± 9,73 bpm, P<0.05) 120 minuti dopo il pasto. Invece, i soggetti che non avevano assunto pomodoro hanno mostrato un incremento significativo dello SI 210 minuti dopo il pasto rispetto al basale (6,98 ± 1,24 m/sec rispetto a 6,58 ± 1,31 m/sec, P<0.05). Non abbiamo osservato modificazioni significative della FMD in tutti i punti dello studio. I nostri dati sono compatibili con un effetto del pomodoro in acuto, in aggiunta al pasto grasso, nel modificare alcuni indici emodinamici e in particolare di rigidità arteriosa. La nostra intenzione è di ampliare la casistica in modo da consolidare i risultati ottenuti, effettuare il dosaggio di metaboliti dell’ossido nitrico e del licopene per tentare di chiarire la fisiopatologia di questo fenomeno. 3) Lo scopo della tesi è di valutare in soggetti con carcinoma renale metastatizzato, l’effetto di farmaci oncologici anti-angiogenetici sui valori di pressione cercando di valutare se l´andamento degli stessi sia associato alla disfunzione endoteliale, alla riduzione dell´elasticitá vasale e/o al danno microcircolatorio. Lo studio ha coinvolto 19 soggetti di età compresa tra 59 e 77 anni, seguiti per un periodo di 3 mesi. Gli incontri si sono svolti in 3 tempi: il giorno di inizio della terapia (T0), a un mese (T1) e a tre mesi (T2) dal primo incontro. I test a cui abbiamo sottoposto i soggetti ad ogni visita sono stati: misurazione della pressione arteriosa con apparecchio elettronico oscillometrico (3 misurazioni a distanza di 5 minuti con il paziente sdraiato), misurazione della funzione endoteliale tramite la tecnica ecografica della vasodilatazione mediata da flusso (FMD: flow mediated dilatation), misurazione della distensibilità carotidea tramite ecografia dei tronchi sovraortici, studio ecocardiografico, capillaroscopia periungueale e raccolta delle urine. L’analisi dei dati ha mostrato un aumento della pressione arteriosa difforme nei pazienti: già dopo il primo mese di terapia anti-angiogenetica, nove pazienti hanno fatto registrare un incremento significativo dei valori di pressione (sia PAS che PAD) per cui è stato necessario incrementare/introdurre la terapia antipertensiva.La concentrazione di nitrati urinari, indice della produzione endogena di ossido nitrico, è risultata ridotta al basale nei sei pazienti con peggioramento pressorio rispetto ai pazienti che si sono mantenuti stabili . Ad un mese i valori di distensibilitá carotidea (DC) erano inferiori nei pazienti con peggioramento dei valori pressori rispetto ai pazienti stabili. Non abbiamo osservato modificazioni significative degli altri parametri emodinamici analizzati nei due gruppi né a 1 mese né a tre mesi. Abbiamo altresí osservato una correlazione inversa tra incremento dei valori di PAS (∆-PAS) e la riduzione dei valori di distensibilitá carotidea (∆-DC) ad un mese (r=-0,52; p<0,05). All’indagine capillascopica basale nessun soggetto presentava alterazioni capillariche senza apparente relazione con le modifiche dei valori pressori. Alla Tomografia Computerizzata (TC) a 6 mesi, 7 soggetti presentavano un quadro di progressione di malattia non correlata ai parametri vascolari. I nostri dati sono compatibili con un effetto dei farmaci anti-angiogenetici nel modificare la pressione arteriosa in pazienti “sensibili”. I dati raccolti suggeriscono un possibile ruolo dell´ossido nitrico o di altri fattori vasoattivi nelle modifiche della pressione arteriosa.

Aims of the study: evaluating the Vascular Endhitelial Growth Factor (VEGF) effect on systemic blood preassure and machanisms of regulation oxid nitric induced. 3 studies were been conducted:1) Aims of the first study: evaluating in vitro role of VEGF and lycopene, present in tomato fruit, on endothelial cells, using Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Materials and methods: HUVECs were been incubated with lycopene (2μM), VEGF and L-NAME were observed by confocal microscopy the NO production in terms of fluorescence intensity (DAF) have been evaluated. Results: the DAF was higher in HUVECS incubated with lycopene (381,1 ± 126,99, p < 0,05 , n = 24 ) compared with control (292,6 ± 107,24 , n = 24); when cells were incubated with VEGF (10ng/ml) the intensity of fluorescence significantly increased (449,7 ± 115,64 p <0,05 , n=8). The supernatant of HUVECs incubated with lycopene showed the highest amounts of nitrate–nitrit. Conclusions: The study shows that the main component of tomato has important biological properties such as preservere endothelial function. Lycopene has been shown to positively modulate the production of intracellular NO.2) Aims of second study: testing whether a 7-day period of tomato paste supplementation can improve some haemodynamic parameters in healthy volunteers (HV) before and after a standardized fat meal.Methods and results: We enrolled 19 male HV in a randomized, single-blind (operator), crossover design. HV maintained a diet poor in vegetables during the study periods, starting a week before randomization. They were randomized either to a supplementation arm (70 g tomato paste per day) for 7 days or to a control arm (no added tomato paste) with a two-week washout periods between the different periods. Flow-Mediated Dilatation (FMD) and Carotid Distendibility (CD) by ultrasounds, Stiffness Index (SI), Reflection Index (RI) by photopletismography and blood pressure (BP), were measured as an estimate of vascular function before and after (2 and 3.5 hours) the fat meal. In the direct comparison between the 2 arms, only the difference in SI was increased in the without-tomato-arm as compared to the tomato-arm both at 2 and 3.5h points (Δ-mean [95%CI]: +0.46m/sec [0.01/0.93] m/sec, +0.55 [0.03/1.07m/sec], P<0.05). After the fat meal, in both arms, HV showed a marked reduction in RI at 2h (-10.7%[-6.7/-14.7%] with tomato paste; -7.2%[-3.0/-11.4%] without tomato paste; P<0.01). Interestingly, only in the tomato-arm, some haemodynamic changes were detectable at 2h with respect to baseline: in particular an increase in brachial artery diameter (+0.20mm[0.06/0.33mm], P<0.01), a reduction in diastolic BP (-2.4 mmHg[0.1/4.7 mmHg], P<0.05) and an increase in heart rate (+3.9bpm [1.4/6.4bpm], P<0.01). The same parameters were not significantly changed in the without-tomato-arm even if they resulted not significantly different between the two arms. The nitrites were higher il tomato group vs placebo one (85, 7 ± 42,2 vs 122,5 ± 83,4 p= 0,05)Conclusion: Tomato supplementation modifies some haemodynamic parameters triggered by a high fat diet suggesting a possible beneficial effect in people assuming a diet rich in tomato.3) Aims of the third study: evaluating the effect of antiangiogenitic drugs (antiVEGF/VEGFR) used in first line therapy in clear cellular carcinoma (CCR) on BP incidence, endothelial function, arterial rigidity and microvascular enviroment. Methods and results: We enrolled 19 hypertensive controlled/normotensive patients candidated to use antiangiogionetic drugs. Vascular test (flow mediated dilatation, carotid distensibility, capillaroscopy and BP) were measured at baseline (time 0 or T0), after 1 month of therapy (Time 1 or T1) and after 3 months of therapy (Time 2 or T2). We demonstrated an increase of BP in 47% of patients at time T1. We divided the population in two groups (patients with no preassure increase at T1 and patients with pressure increase at T1). At baseline population present some differences in particular levels of preassure (PAS 141,5±14,2 vs 123,1 ±11,9 p=0,008 e PAD 87,4±8,6 vs 77,7±8,0; p= 0,002), nitrates (no BP T1 92,7±46 vs BP T1 125±92 uM/mmol) and PLTs (no BP T1 218±56,8 and BP T1442±273,5; p =0,016). We documented a linear correlation betwen preassure increase and riduction in carotid distensibility at T1 (r=-0,52; p<0,05). The capillaroscopy was modified in 53% of patients after 1 month of therapy but with no significant differences in the two groups. Conclusion: the antiVGF therapy in our population determined an increase in BP and a modification in vassels structure tested with capillaroscopy. Although there were no correlations between preassure and capillary modifications. All those mechanisms can explain the important role of VEGF in blood preassure control. No direct correlation was identified between vascular caratheristics and cancer evolution.