L’uso dei fertilizzanti in agricoltura sta diventando sempre più oneroso non solo dal punto di vista economico, ma soprattutto per l’impatto ambientale che esso ha. In questo conteso un obiettivo di ricerca importante è quello di migliorare l’efficienza di assorbimento da parte delle piante, in quanto è ormai assodato che gli apparati radicali recuperano quote piuttosto ridotte dei fertilizzanti applicati. Questi aspetti sono stati molto spesso affrontati empiricamente con un approccio dose-effetto invece che attraverso un attento studio dei meccanismi biochimici e molecolari che ne stanno alla base. Gli ioni nitrato e ammonio presenti nel suolo sono le due principali fonti di azoto per le piante coltivate alle nostre latitudini. Per l’assorbimento del nitrato, le piante hanno sviluppato due distinti sistemi di trasporto, uno ad alta affinità (HATS, high-affinity transport system) e uno a bassa affinità (LATS, low-affinity transport system); entrambi sono caratterizzati dalla presenza di una componente costitutiva e una inducibile dalla presenza dell’anione. Il presente lavoro è stato focalizzato sulla caratterizzazione biochimica e molecolare dei trasportatori ad alta affinità del nitrato in Zea mays (Pioneer, hybrid PR33T56) con riferimento anche ai meccanismi regolatori che ne sottendono l’attività. Attraverso l’uso di 15 N sono state studiate le variazioni della velocità di assorbimento dello ione da parte di radici di piante eziolate di 4 giorni, cresciute in coltura idroponica e successivamente messe a contatto con una soluzione nutritiva contenente nitrato 500 μM. Per il sistema HATS, la più alta velocità di assorbimento è stata riscontrata dopo 8 ore di contatto fra radici e nitrato. Usando il database Maizesequence Browser, sono stati identificati 4 putativi geni codificanti trasportatori ad alta affinità (NRT2) e due putativi geni NAR2; quest’ultimi codificano per una proteina che si è rivelata necessaria per conferire funzionalità ai trasportatori NRT2 di Arabidopsis thaliana e Hordeum vulgare. Ai diversi tempi di trattamento, sulla base delle informazioni di sequenza ottenute dal genoma, sono state effettuate, sia nelle radici che nel germoglio, analisi di espressione dei geni (real time RT-PCR) codificanti i trasportatori NRT2 e le proteine NAR2. In radice, il gene ZmNRT2.2 ha mostrato di avere la più alta induzione, seguendo il comportamento fisiologico precedentemente studiato. Riguardo i geni NAR2, solamente il trascritto del putativo gene ZmNAR2.1 risultava indotto e con un andamento di espressione simile a quello del gene ZmNRT2.2 suggerendo un suo possibile coinvolgimento nel fenomeno. Lo sviluppo di un anticorpo specifico per i trasportatori NRT2 ha dato la possibilità di studiare, attraverso analisi Western-blot, le variazioni a livello proteico dei geni identificati. L’andamento di questi correlava solo parzialmente con l’attività di trasporto Tale risultato suggerisce che modificazioni post-traduzionali possano regolare l’attività dei trasportatori stessi Un possibile, anche se non esclusivo, candidato per questo tipo di regolazione, potrebbe essere una proteina della famiglia NAR2 la cui associazione fisica con i trasportatori del nitrato è stata vista essere, in Arabidopsis e Orzo, condizione necessaria per conferire loro proprietà di trasporto. Per chiarire questo aspetto sono in corso indagini mediante elettroforesi nativa delle proteine di membrana.
Caratterizzazione fisiologica e molecolare dei trasportatori ad alta affinità del nitrato in radici di mais
ZAMBONI, Anita;VARANINI, Zeno
2011-01-01
Abstract
L’uso dei fertilizzanti in agricoltura sta diventando sempre più oneroso non solo dal punto di vista economico, ma soprattutto per l’impatto ambientale che esso ha. In questo conteso un obiettivo di ricerca importante è quello di migliorare l’efficienza di assorbimento da parte delle piante, in quanto è ormai assodato che gli apparati radicali recuperano quote piuttosto ridotte dei fertilizzanti applicati. Questi aspetti sono stati molto spesso affrontati empiricamente con un approccio dose-effetto invece che attraverso un attento studio dei meccanismi biochimici e molecolari che ne stanno alla base. Gli ioni nitrato e ammonio presenti nel suolo sono le due principali fonti di azoto per le piante coltivate alle nostre latitudini. Per l’assorbimento del nitrato, le piante hanno sviluppato due distinti sistemi di trasporto, uno ad alta affinità (HATS, high-affinity transport system) e uno a bassa affinità (LATS, low-affinity transport system); entrambi sono caratterizzati dalla presenza di una componente costitutiva e una inducibile dalla presenza dell’anione. Il presente lavoro è stato focalizzato sulla caratterizzazione biochimica e molecolare dei trasportatori ad alta affinità del nitrato in Zea mays (Pioneer, hybrid PR33T56) con riferimento anche ai meccanismi regolatori che ne sottendono l’attività. Attraverso l’uso di 15 N sono state studiate le variazioni della velocità di assorbimento dello ione da parte di radici di piante eziolate di 4 giorni, cresciute in coltura idroponica e successivamente messe a contatto con una soluzione nutritiva contenente nitrato 500 μM. Per il sistema HATS, la più alta velocità di assorbimento è stata riscontrata dopo 8 ore di contatto fra radici e nitrato. Usando il database Maizesequence Browser, sono stati identificati 4 putativi geni codificanti trasportatori ad alta affinità (NRT2) e due putativi geni NAR2; quest’ultimi codificano per una proteina che si è rivelata necessaria per conferire funzionalità ai trasportatori NRT2 di Arabidopsis thaliana e Hordeum vulgare. Ai diversi tempi di trattamento, sulla base delle informazioni di sequenza ottenute dal genoma, sono state effettuate, sia nelle radici che nel germoglio, analisi di espressione dei geni (real time RT-PCR) codificanti i trasportatori NRT2 e le proteine NAR2. In radice, il gene ZmNRT2.2 ha mostrato di avere la più alta induzione, seguendo il comportamento fisiologico precedentemente studiato. Riguardo i geni NAR2, solamente il trascritto del putativo gene ZmNAR2.1 risultava indotto e con un andamento di espressione simile a quello del gene ZmNRT2.2 suggerendo un suo possibile coinvolgimento nel fenomeno. Lo sviluppo di un anticorpo specifico per i trasportatori NRT2 ha dato la possibilità di studiare, attraverso analisi Western-blot, le variazioni a livello proteico dei geni identificati. L’andamento di questi correlava solo parzialmente con l’attività di trasporto Tale risultato suggerisce che modificazioni post-traduzionali possano regolare l’attività dei trasportatori stessi Un possibile, anche se non esclusivo, candidato per questo tipo di regolazione, potrebbe essere una proteina della famiglia NAR2 la cui associazione fisica con i trasportatori del nitrato è stata vista essere, in Arabidopsis e Orzo, condizione necessaria per conferire loro proprietà di trasporto. Per chiarire questo aspetto sono in corso indagini mediante elettroforesi nativa delle proteine di membrana.
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