La Tubercolosi rappresenta una delle principali cause di mortalità da malattia infettiva. Il bacillo di Calmette-Guérin (BCG), un ceppo vivo attenuato del Mycobacterium bovis, è l’unico vaccino attualmente disponibile per la tubercolosi, nonostante non protegga da alcune forme di questa malattia considerata riemergente. Pertanto, lo sviluppo di un vaccino più adeguato ed efficace è essenziale per migliorare il controllo della tubercolosi. E’ stato proposto che la limitata protezione conferita dal BCG possa essere parzialmente dovuta alla sua mancata espressione di importanti proteine immunogeniche. Dunque, è concepibile pensare che antigeni del Mtb che non sono espressi dai ceppi BCG, possano incrementare l’efficacia della vaccinazione da BCG. Una recente strategia di vaccinazione proposta per aumentare l’effetto della formulazione di un vaccino è l’inserzione di antigeni in nanoparticelle (NP) che possono evitare la loro rapida distruzione da parte dell’organismo ospite e possono promuovere la loro cattura da parte di specifiche cellule presentanti l’antigene (APC). Sulla base di queste premesse e considerando il ruolo chiave svolto dalle cellule dendritiche umane (DC) nelle difese contro la TB e più in generale, nella vaccinazione, questa tesi è stata finalizzata alla scoperta di nuove strategie, coinvolgenti la risposta immunitaria mediata dalle DC, per migliorare l’efficacia della vaccinazione da BCG. In particolare, lo studio si è focalizzato su due principali argomenti: • Indagine degli effetti degli antigeni di Mtb, HspX e ESAT-6, sull’attività delle DC umane al fine di verificare il loro potenziale utilizzo come componenti del vaccino (task A), • Analisi di un nano-sistema di trasporto basato su NP di PLGA (acido polilatico co-glicolico) o pSi (silicio poroso) per potenziare la cattura delle formulazioni vacciniche da parte delle DC umane (task B). Task A. In questa parte dello studio abbiamo scoperto che l’aggiunta dei singoli antigeni ESAT-6 o HspX alle DC stimolate con BCG non modifica né la maturazione di tali cellule né la secrezione di citochine proinfiammatorie. Tuttavia, la stimolazione delle DC con BCG e con entrambi HspX e ESAT-6 (BCG/HspX/ESAT-6), aumenta significativamente l’espressione dei marcatori di maturazione CD83, CD86 e MHCII, e induce il rilascio di IL-12, TNFα, IL-6, IL-23 e IL-1β da queste cellule. Inoltre, il trattamento delle DC con BCG/HspX/ESAT-6 aumenta la capacità di queste cellule di indurre il rilascio di IFN-γ e l’espressione di CD69 dai linfociti CD4+ e dalle cellule NK rispetto al trattamento delle DC con solo il BCG o con il BCG e i singoli antigeni. Abbiamo anche visto che il trattamento con un anticorpo bloccante anti-TLR2 riduce il rilascio di IL-12 dalle DC stimolate con BCG/HspX/ESAT-6 ed anche la secrezione di IFN-γ da linfociti CD4+ cocoltivati con queste cellule. Inoltre, HspX e ESAT -6 migliorano la capacità di DC trattate con BCG di indurre l’espressione del marcatore del fenotipo “memory”, CD45RO nei linfociti T naive. I nostri risultati indicano che BCG, HspX e ESAT-6 cooperano per consentire alle DC umane di indurre una sostanziale risposta immunitaria mediata dai linfociti T e delle cellule NK attraverso la secrezione di IL-12 TLR2-dipendente. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che HspX e ESAT -6 risultano essere due buoni candidati per migliorare l'efficacia della vaccinazione BCG . Task B. Considerando la loro biocompatibilità e la loro rilevanza nella letteratura scientifica, sono stati utilizzati due diversi tipi di NP: PLGA e pSi. I nostri risultati mostrano che a dosi fino a 0,2 mg , che sono ampiamente considerate appropriate per la stimolazione in vitro di cellule dendritiche, sia le NP di PLGA che di pSi non influenzano la vitalità delle cellule. Tuttavia, a dosi superiori a 0,4 mg , le NP di PLGA , ma non quelle di pSi, inducono apoptosi delle DC, indicando che le pSi sono meno tossiche rispetto alle NP di PLGA. Quindi, la quantità di NP utilizzate nei nostri esperimenti sono state scelte di conseguenza. In questa parte del lavoro abbiamo trovato che nè le NP di PLGA nè quelle di pSi sono in grado di modificare di per sé la secrezione di citochine pro-infiammatorie quali IL-12, TNFα, IL- 6 e IL-23 sia in DC non stimolate, sia in DC stimolate con LPS. È interessante notare come l'analisi di microscopia confocale abbia rivelato che sia le NP di PLGA che le pSi vengono ingerite dalle DC. Tuttavia, è stato possibile osservare che le NP di PLGA vengono più efficacemente internalizzate dalle DC rispetto alle pSi. Queste evidenze suggeriscono che le NP di PLGA potrebbero essere uno strumento adatto da essere impiegato per il trasporto di molecole all’interno di cellule dendritiche umane . L’insieme dei nostri risultati, pone l’attenzione su una nuova possibile strategia di vaccinazione contro la TBC basata su i) la combinazione di BCG/HspX/ESAT-6 al fine di stimolare il sistema immunitario, e ii ) l'uso di NP di PLGA per indirizzare gli antigeni nelle cellule dendritiche umane.

Tuberculosis (TB) represents one of the major causes of mortality from an infectious disease. The bacillus Calmette-Guérin (BCG), a live attenuated strain of Mycobacterium bovis, is the only available TB vaccine despite it doesn’t protect against some forms of this re-emerging disease. Therefore, the development of a more adequate vaccine is essential for improving tuberculosis control. It has been suggested that the limited protection conferred by BCG is partly due to his missing expression of critical immunogenic proteins. Hence, it is conceivable that Mtb antigens not expressed by BCG strains could increase the efficacy of BCG vaccination. A recently proposed strategy to improve the efficiency of a vaccine formulation is the encapsulation of antigens into nanoparticles (NPs) that can avoid their rapid clearance by host organisms and can promote their capture by specific antigen presenting cells (APCs). On the basis of these premises and considering the key role played by human dendritic cells (DCs) in the defences against TB and, more generally, in vaccination, this thesis has been aimed at the discovery of new strategies, involving human DC mediated immune response, to improve the BCG effectiveness. In particular, the study has been focused on two main goals: • investigation of the effects of Mtb antigens, HspX and ESAT-6, on human DC activity in order to verify their potential use as vaccine components (task A), • analysis of a vaccine nano-delivery system based on PLGA or pSi NPs to improve the capture of vaccine formulations by human DCs (task B). Task A. In this part of the study we found that the addition of HspX or ESAT-6 to BCG stimulated DCs does not affect DC maturation and pro inflammatory cytokine secretion. However DC stimulation with BCG and both HspX and ESAT-6 (BCG/HspX/ESAT-6) greatly enhances the expression of DC maturation markers CD83, CD86 and MHCII, and induces the release of IL-12, TNF α, IL-6, IL-23 and IL-1β from these cells. Interestingly, DC treatment with BCG/HspX/ESAT-6 improves the ability of these cells to elicit IFN-γ release and CD69 expression by CD4+ lymphocytes and NK cells as compared to DC treatment with BCG alone or with BCG plus a single antigen. Moreover, a TLR2-blocking antibody decreases IL-12 release by DCs stimulated with BCG/HspX/ESAT-6, as well as IFN-γ secretion by CD4+ lymphocytes co-cultured with these cells. Furthermore, HspX and ESAT-6 improve the capacity of BCG treated DCs to induce the expression of memory phenotype marker CD45RO in naïve CD4+ T cells. Our results indicate that BCG, HspX and ESAT-6 cooperate in enabling human DCs to induce a substantial T lymphocyte and NK cell mediated immune responses through TLR2-dependent IL-12 secretion. Therefore our findings suggest that HspX and ESAT-6 represent good candidates for improving the effectiveness of BCG vaccination. Task B. Considering their biocompatibility and their relevance in the scientific literature, two different types of NPs have been utilized: PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid) and pSi (porous silicon). Our results show that at doses up to 0.2 mg, which are widely considered appropriate for in vitro DCs stimulation, both PLGA and pSi NPs do not affect human DC viability. However, at doses exceeding 0.4 mg, PLGA, but not pSi NPs induce DC apoptosis, indicating that pSi NPs are less toxic than PLGA NPs. Hence, the amounts of NPs used in our experiments have been chosen accordingly. In this part of the work we found that PLGA and pSi NPs are unable to modify per se the secretion of pro-inflammatory cytokines IL-12, TNF α, IL-6 and IL-23 by both resting and LPS-stimulated DCs. Interestingly, a confocal microscopy analysis reveals that both PLGA and pSi NPs are ingested by human DCs. However, PLGA NPs are more efficiently internalized by DCs than pSi NPs, indicating that PLGA NPs could be a suitable tool to be used for targeting molecules into human DCs. Take together our results suggest a new vaccination strategy against TB based on i) the combination of BCG/HspX/ESAT-6 in order to stimulate the immune system, and ii) the use of PLGA NPs to target antigens into human DCs.

New Strategy involving dendritic cell mediated immune response to improve TB vaccination

Marongiu, Laura
2014-01-01

Abstract

Tuberculosis (TB) represents one of the major causes of mortality from an infectious disease. The bacillus Calmette-Guérin (BCG), a live attenuated strain of Mycobacterium bovis, is the only available TB vaccine despite it doesn’t protect against some forms of this re-emerging disease. Therefore, the development of a more adequate vaccine is essential for improving tuberculosis control. It has been suggested that the limited protection conferred by BCG is partly due to his missing expression of critical immunogenic proteins. Hence, it is conceivable that Mtb antigens not expressed by BCG strains could increase the efficacy of BCG vaccination. A recently proposed strategy to improve the efficiency of a vaccine formulation is the encapsulation of antigens into nanoparticles (NPs) that can avoid their rapid clearance by host organisms and can promote their capture by specific antigen presenting cells (APCs). On the basis of these premises and considering the key role played by human dendritic cells (DCs) in the defences against TB and, more generally, in vaccination, this thesis has been aimed at the discovery of new strategies, involving human DC mediated immune response, to improve the BCG effectiveness. In particular, the study has been focused on two main goals: • investigation of the effects of Mtb antigens, HspX and ESAT-6, on human DC activity in order to verify their potential use as vaccine components (task A), • analysis of a vaccine nano-delivery system based on PLGA or pSi NPs to improve the capture of vaccine formulations by human DCs (task B). Task A. In this part of the study we found that the addition of HspX or ESAT-6 to BCG stimulated DCs does not affect DC maturation and pro inflammatory cytokine secretion. However DC stimulation with BCG and both HspX and ESAT-6 (BCG/HspX/ESAT-6) greatly enhances the expression of DC maturation markers CD83, CD86 and MHCII, and induces the release of IL-12, TNF α, IL-6, IL-23 and IL-1β from these cells. Interestingly, DC treatment with BCG/HspX/ESAT-6 improves the ability of these cells to elicit IFN-γ release and CD69 expression by CD4+ lymphocytes and NK cells as compared to DC treatment with BCG alone or with BCG plus a single antigen. Moreover, a TLR2-blocking antibody decreases IL-12 release by DCs stimulated with BCG/HspX/ESAT-6, as well as IFN-γ secretion by CD4+ lymphocytes co-cultured with these cells. Furthermore, HspX and ESAT-6 improve the capacity of BCG treated DCs to induce the expression of memory phenotype marker CD45RO in naïve CD4+ T cells. Our results indicate that BCG, HspX and ESAT-6 cooperate in enabling human DCs to induce a substantial T lymphocyte and NK cell mediated immune responses through TLR2-dependent IL-12 secretion. Therefore our findings suggest that HspX and ESAT-6 represent good candidates for improving the effectiveness of BCG vaccination. Task B. Considering their biocompatibility and their relevance in the scientific literature, two different types of NPs have been utilized: PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid) and pSi (porous silicon). Our results show that at doses up to 0.2 mg, which are widely considered appropriate for in vitro DCs stimulation, both PLGA and pSi NPs do not affect human DC viability. However, at doses exceeding 0.4 mg, PLGA, but not pSi NPs induce DC apoptosis, indicating that pSi NPs are less toxic than PLGA NPs. Hence, the amounts of NPs used in our experiments have been chosen accordingly. In this part of the work we found that PLGA and pSi NPs are unable to modify per se the secretion of pro-inflammatory cytokines IL-12, TNF α, IL-6 and IL-23 by both resting and LPS-stimulated DCs. Interestingly, a confocal microscopy analysis reveals that both PLGA and pSi NPs are ingested by human DCs. However, PLGA NPs are more efficiently internalized by DCs than pSi NPs, indicating that PLGA NPs could be a suitable tool to be used for targeting molecules into human DCs. Take together our results suggest a new vaccination strategy against TB based on i) the combination of BCG/HspX/ESAT-6 in order to stimulate the immune system, and ii) the use of PLGA NPs to target antigens into human DCs.
2014
Dendritic Cells; innate immunity; T cell
La Tubercolosi rappresenta una delle principali cause di mortalità da malattia infettiva. Il bacillo di Calmette-Guérin (BCG), un ceppo vivo attenuato del Mycobacterium bovis, è l’unico vaccino attualmente disponibile per la tubercolosi, nonostante non protegga da alcune forme di questa malattia considerata riemergente. Pertanto, lo sviluppo di un vaccino più adeguato ed efficace è essenziale per migliorare il controllo della tubercolosi. E’ stato proposto che la limitata protezione conferita dal BCG possa essere parzialmente dovuta alla sua mancata espressione di importanti proteine immunogeniche. Dunque, è concepibile pensare che antigeni del Mtb che non sono espressi dai ceppi BCG, possano incrementare l’efficacia della vaccinazione da BCG. Una recente strategia di vaccinazione proposta per aumentare l’effetto della formulazione di un vaccino è l’inserzione di antigeni in nanoparticelle (NP) che possono evitare la loro rapida distruzione da parte dell’organismo ospite e possono promuovere la loro cattura da parte di specifiche cellule presentanti l’antigene (APC). Sulla base di queste premesse e considerando il ruolo chiave svolto dalle cellule dendritiche umane (DC) nelle difese contro la TB e più in generale, nella vaccinazione, questa tesi è stata finalizzata alla scoperta di nuove strategie, coinvolgenti la risposta immunitaria mediata dalle DC, per migliorare l’efficacia della vaccinazione da BCG. In particolare, lo studio si è focalizzato su due principali argomenti: • Indagine degli effetti degli antigeni di Mtb, HspX e ESAT-6, sull’attività delle DC umane al fine di verificare il loro potenziale utilizzo come componenti del vaccino (task A), • Analisi di un nano-sistema di trasporto basato su NP di PLGA (acido polilatico co-glicolico) o pSi (silicio poroso) per potenziare la cattura delle formulazioni vacciniche da parte delle DC umane (task B). Task A. In questa parte dello studio abbiamo scoperto che l’aggiunta dei singoli antigeni ESAT-6 o HspX alle DC stimolate con BCG non modifica né la maturazione di tali cellule né la secrezione di citochine proinfiammatorie. Tuttavia, la stimolazione delle DC con BCG e con entrambi HspX e ESAT-6 (BCG/HspX/ESAT-6), aumenta significativamente l’espressione dei marcatori di maturazione CD83, CD86 e MHCII, e induce il rilascio di IL-12, TNFα, IL-6, IL-23 e IL-1β da queste cellule. Inoltre, il trattamento delle DC con BCG/HspX/ESAT-6 aumenta la capacità di queste cellule di indurre il rilascio di IFN-γ e l’espressione di CD69 dai linfociti CD4+ e dalle cellule NK rispetto al trattamento delle DC con solo il BCG o con il BCG e i singoli antigeni. Abbiamo anche visto che il trattamento con un anticorpo bloccante anti-TLR2 riduce il rilascio di IL-12 dalle DC stimolate con BCG/HspX/ESAT-6 ed anche la secrezione di IFN-γ da linfociti CD4+ cocoltivati con queste cellule. Inoltre, HspX e ESAT -6 migliorano la capacità di DC trattate con BCG di indurre l’espressione del marcatore del fenotipo “memory”, CD45RO nei linfociti T naive. I nostri risultati indicano che BCG, HspX e ESAT-6 cooperano per consentire alle DC umane di indurre una sostanziale risposta immunitaria mediata dai linfociti T e delle cellule NK attraverso la secrezione di IL-12 TLR2-dipendente. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che HspX e ESAT -6 risultano essere due buoni candidati per migliorare l'efficacia della vaccinazione BCG . Task B. Considerando la loro biocompatibilità e la loro rilevanza nella letteratura scientifica, sono stati utilizzati due diversi tipi di NP: PLGA e pSi. I nostri risultati mostrano che a dosi fino a 0,2 mg , che sono ampiamente considerate appropriate per la stimolazione in vitro di cellule dendritiche, sia le NP di PLGA che di pSi non influenzano la vitalità delle cellule. Tuttavia, a dosi superiori a 0,4 mg , le NP di PLGA , ma non quelle di pSi, inducono apoptosi delle DC, indicando che le pSi sono meno tossiche rispetto alle NP di PLGA. Quindi, la quantità di NP utilizzate nei nostri esperimenti sono state scelte di conseguenza. In questa parte del lavoro abbiamo trovato che nè le NP di PLGA nè quelle di pSi sono in grado di modificare di per sé la secrezione di citochine pro-infiammatorie quali IL-12, TNFα, IL- 6 e IL-23 sia in DC non stimolate, sia in DC stimolate con LPS. È interessante notare come l'analisi di microscopia confocale abbia rivelato che sia le NP di PLGA che le pSi vengono ingerite dalle DC. Tuttavia, è stato possibile osservare che le NP di PLGA vengono più efficacemente internalizzate dalle DC rispetto alle pSi. Queste evidenze suggeriscono che le NP di PLGA potrebbero essere uno strumento adatto da essere impiegato per il trasporto di molecole all’interno di cellule dendritiche umane . L’insieme dei nostri risultati, pone l’attenzione su una nuova possibile strategia di vaccinazione contro la TBC basata su i) la combinazione di BCG/HspX/ESAT-6 al fine di stimolare il sistema immunitario, e ii ) l'uso di NP di PLGA per indirizzare gli antigeni nelle cellule dendritiche umane.
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