Il reclutamento leucocitario è un importante meccanismo d’immunosorveglianza che permette alle cellule del sistema immunitario di migrare da e verso i tessuti periferici garantendo la corretta attuazione della risposta immunitaria. L’interazione tra leucociti ed endotelio è mediata da selectine, integrine e poteine appartenenti alla superfamiglia della immunoglobuline. Nel processo sono coinvolte anche glicoproteine come le mucine, che fungono da ligandi selectinici. Le selectine giocano un ruolo centrale nel trafficking leucocitario mediando le prima fasi di cattura, tethering, e rolling sulla superficie endoteliale. Le Tims sono una famiglia di glicoproteine in grado d’interagire con diversi ligandi. La loro struttura, e in particolare quella di Tim-1, è simile a quella di MADCAM-1(mucin mucosal addressin cell adhesion molecule 1 ), una classica molecola d’adesione coinviolta nel reclutamento leucocitario in grado di legare sia integrine che selectine. Inoltre il dominio mucinico di Tim-1 esibisce moltissimi siti di N e O glicosilazione presenti anche nel dominio mucinico di PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand 1 ), il ligando selectinico magggiormente caratterizzato. Tutte queste informazioni strutturali ci hanno fatto ipotizzare un ruolo per Tim-1 nel mediare il reclutamento leucocitario sul sito di infiammazione in quanto molecole altamente glicosilate come le mucine, e con le suddette caratteristiche strutturali, sono tipicamente coinvolte in questo processo. Più specificatamente abbiamo cercato di comprendere se Tim-1 sia in grado di legare le selectine e quindi mediare il reclutamento di leucociti sull’endotelio in una maniera selectina-dipendente. In questo lavoro dimostriamo che Tim-1 è un nuovo ligando selectinico. Tim-1 è infatti in grado di legare P-selectin in una maniera calcio dipendente in vitro. Successivamente abbiamo dimostrato l’importanza di Tim-1 nel mediare tethering e rolling di cellule Th1 e Th17 sotto flusso in vitro: cellule mutanti, prive del dominio mucinico di Tim-1, esibiscono una forte riduzione nella capacità di tethering e rolling su P-selectin. Successivamente, per valutare l’importanza del legame Tim-1 - P-selectin anche in vivo abbiamo eseguito esperimenti di microscopia intravitale in venule mesenteriche murine attivate con trombina, ottenendo un modello d’infiammazione P-selectin dipendente. Anche in questo modello la mancanza del dominio mucinico di Tim-1 incide fortemente nella capacità di tethering e rolling di cellule Th1 e Th17. Successivamente abbiamo utilizzato un modello murino di CHS (contact hypersensitivity) per valutare un possible ruolo fisiologico del legame Tim-1 - P-selectin in vivo nel reclutamento leucocitario durante la risposta infiammatoria. La mancanza di Tim-1 in questo modello infiammatorio si traduce in una minor capacità migratoria di celluel T al sito d’infiammazione. Infine abbiamo dimostrato l’importanza di Tim-1 nel mediare reclutamento di cellue Th1 e Th17 nel sistema nervoso centrale. Esperimenti di microscopia intravitale nelle venule piali del cervello hanno dimostrato che cellule Th1 e Th17 prive del dominio mucinico di Tim-1 interagiscono meno con l’endotelio cerebrale infiammato. Le venule piali sono inoltre un punto d’accesso molto importante per le cellule T durante le fasi iniziali di sviluppo dell’encefalite sperimentale autoimmune; il modello murino di sclerosi muplitpla. Abbiamo quindi investigato il coinvolgimento di Tim-1 nello sviluppo di questo modello. La mancanza del dominio mucinico di Tim-1 risulta in uno sviluppo meno severo della patologia con livelli minori d’infiltrato pro-infiammatorio a livello del parenchima cerebrale. Collettivamente i nostri dati dimostrano che Tim-1 è un nuovo ligando per P-selectin con un ruolo specifico nel mediare il reclutamento leucocitario durante le risposte infiammatorie e l’induzione di patologie autoimmuni.

Leucocyte trafficking is an important mechanism of immune surveillance that enables immune cells to migrate to and from peripheral tissues, providing primary and secondary immune responses as requested. The interaction between leukocytes and the inflamed endothelium are mediated by selectins, integrins, and immunoglobulin (Ig) gene super family proteins. Moreover, other important glycoproteins involved in this process are the mucins, which serve as glycoprotein ligands for selectins. Selectins play a central role in leukocyte trafficking by mediating the first phases of tethering and rolling on vascular surfaces. Tims proteins are a class of mucin able to bind a diverse set of ligands. The structure of Tim proteins, in particular the one of Tim-1 is similar to those of the mucin mucosal addressin cell adhesion molecule (MadCAM)-1, a classical adhesion receptor involved in leukocyte trafficking in the immune system able to bind both selectins and integrins. The mucin domain of Tims protein exhibit several sites of O- and N- glycosilation similar to those observed on P-selectin glycoprotein ligand (PSGL)-1; the most charachterized ligand of selectins. Moreover, it has been shown that the IgV domain of Tim-1, exhibits characteristics of the C-type lectins, as its non-species-specific binding to carbohydrate moieties of several cell types is calcium sensitive and is reduced in cells with defective O- and N-linked carbohydrate synthesis. All these structural observations led us to investigate a potential role for Tim-1 in leukocyte trafficking in inflamed tissues as highly glycosilated molecules like C-type lectins, mucins, integrins and Ig-superfamily members are involved in this process. For this reasons we initially tested the ability of Tim-1 to bind selectin, that are known to interact with highly glycosilated mucin like Tim-1. Here we report that T cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a novel P-selectin ligand. We first reported the ability of both human and murine Tim-1 to bind P-selectin in vitro and under shear stress conditions in a cell free system. We then demonstrated the importance of TIM-1 in mediating tethering and rolling of Th1 and Th17 cells on P-selectin in underflow rolling assays. Cells lacking the mucin domain of Tim-1 displayed a strong reduced ability to interact with P-selectin underflow in vitro. To evaluate the importance of Tim-1 –P-selectin binding in vivo we performed intravital microscopy in thrombin-activated mesenteric venules displaying that Th1 and Th17 cells lacking the TIM-1 mucin domain showed reduced rolling ability in vivo in a P-selectin dependent model of inlammation. Uniquely, the TIM-1 IgV domain was also required for P-selectin binding. To evaluate a potential physiologic role for Tim-1/P-selectin interaction in mediating leukocyte trafficking in vivo during inflammatory responses, we demonstrated that inhibition of TIM-1 reduced T cell recruitment in a contact hypersensivity model (CHS) of inlammation. We then demonstrated the importance of Tim-1 in mediating T cell recruitment in the inflamed brain microcirculation adopting intravital microscopy in brain pial venules. Also in this model we have shown that the lacking of Tim-1 mucin domain resulted in a strong reduced ability of Th1 and Th17 cells to interact with the inflamed endothelium. Finally as brain pial venules are a key entry point for T cells in the early phases of development of EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) we checked the involvement of Tim-1 in this model. We discovered that lack of Tim-1 mucin domain resulted in a less severe development of the pathology correlating with a lower T cell accumulation in the CNS. Collectively our data demonstrate that TIM-1 is a major P-selectin ligand with a specialized role in T cell trafficking during inflammatory responses and the induction of autoimmune disease.

Tim-1 is a physiological P-selectin ligand that mediates T cell trafficking during inflammation

DONNARUMMA, Tiziano
2014-01-01

Abstract

Leucocyte trafficking is an important mechanism of immune surveillance that enables immune cells to migrate to and from peripheral tissues, providing primary and secondary immune responses as requested. The interaction between leukocytes and the inflamed endothelium are mediated by selectins, integrins, and immunoglobulin (Ig) gene super family proteins. Moreover, other important glycoproteins involved in this process are the mucins, which serve as glycoprotein ligands for selectins. Selectins play a central role in leukocyte trafficking by mediating the first phases of tethering and rolling on vascular surfaces. Tims proteins are a class of mucin able to bind a diverse set of ligands. The structure of Tim proteins, in particular the one of Tim-1 is similar to those of the mucin mucosal addressin cell adhesion molecule (MadCAM)-1, a classical adhesion receptor involved in leukocyte trafficking in the immune system able to bind both selectins and integrins. The mucin domain of Tims protein exhibit several sites of O- and N- glycosilation similar to those observed on P-selectin glycoprotein ligand (PSGL)-1; the most charachterized ligand of selectins. Moreover, it has been shown that the IgV domain of Tim-1, exhibits characteristics of the C-type lectins, as its non-species-specific binding to carbohydrate moieties of several cell types is calcium sensitive and is reduced in cells with defective O- and N-linked carbohydrate synthesis. All these structural observations led us to investigate a potential role for Tim-1 in leukocyte trafficking in inflamed tissues as highly glycosilated molecules like C-type lectins, mucins, integrins and Ig-superfamily members are involved in this process. For this reasons we initially tested the ability of Tim-1 to bind selectin, that are known to interact with highly glycosilated mucin like Tim-1. Here we report that T cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a novel P-selectin ligand. We first reported the ability of both human and murine Tim-1 to bind P-selectin in vitro and under shear stress conditions in a cell free system. We then demonstrated the importance of TIM-1 in mediating tethering and rolling of Th1 and Th17 cells on P-selectin in underflow rolling assays. Cells lacking the mucin domain of Tim-1 displayed a strong reduced ability to interact with P-selectin underflow in vitro. To evaluate the importance of Tim-1 –P-selectin binding in vivo we performed intravital microscopy in thrombin-activated mesenteric venules displaying that Th1 and Th17 cells lacking the TIM-1 mucin domain showed reduced rolling ability in vivo in a P-selectin dependent model of inlammation. Uniquely, the TIM-1 IgV domain was also required for P-selectin binding. To evaluate a potential physiologic role for Tim-1/P-selectin interaction in mediating leukocyte trafficking in vivo during inflammatory responses, we demonstrated that inhibition of TIM-1 reduced T cell recruitment in a contact hypersensivity model (CHS) of inlammation. We then demonstrated the importance of Tim-1 in mediating T cell recruitment in the inflamed brain microcirculation adopting intravital microscopy in brain pial venules. Also in this model we have shown that the lacking of Tim-1 mucin domain resulted in a strong reduced ability of Th1 and Th17 cells to interact with the inflamed endothelium. Finally as brain pial venules are a key entry point for T cells in the early phases of development of EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) we checked the involvement of Tim-1 in this model. We discovered that lack of Tim-1 mucin domain resulted in a less severe development of the pathology correlating with a lower T cell accumulation in the CNS. Collectively our data demonstrate that TIM-1 is a major P-selectin ligand with a specialized role in T cell trafficking during inflammatory responses and the induction of autoimmune disease.
2014
mucin domain 1 (TIM-1); inflammation; leukocyte recruitment
Il reclutamento leucocitario è un importante meccanismo d’immunosorveglianza che permette alle cellule del sistema immunitario di migrare da e verso i tessuti periferici garantendo la corretta attuazione della risposta immunitaria. L’interazione tra leucociti ed endotelio è mediata da selectine, integrine e poteine appartenenti alla superfamiglia della immunoglobuline. Nel processo sono coinvolte anche glicoproteine come le mucine, che fungono da ligandi selectinici. Le selectine giocano un ruolo centrale nel trafficking leucocitario mediando le prima fasi di cattura, tethering, e rolling sulla superficie endoteliale. Le Tims sono una famiglia di glicoproteine in grado d’interagire con diversi ligandi. La loro struttura, e in particolare quella di Tim-1, è simile a quella di MADCAM-1(mucin mucosal addressin cell adhesion molecule 1 ), una classica molecola d’adesione coinviolta nel reclutamento leucocitario in grado di legare sia integrine che selectine. Inoltre il dominio mucinico di Tim-1 esibisce moltissimi siti di N e O glicosilazione presenti anche nel dominio mucinico di PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand 1 ), il ligando selectinico magggiormente caratterizzato. Tutte queste informazioni strutturali ci hanno fatto ipotizzare un ruolo per Tim-1 nel mediare il reclutamento leucocitario sul sito di infiammazione in quanto molecole altamente glicosilate come le mucine, e con le suddette caratteristiche strutturali, sono tipicamente coinvolte in questo processo. Più specificatamente abbiamo cercato di comprendere se Tim-1 sia in grado di legare le selectine e quindi mediare il reclutamento di leucociti sull’endotelio in una maniera selectina-dipendente. In questo lavoro dimostriamo che Tim-1 è un nuovo ligando selectinico. Tim-1 è infatti in grado di legare P-selectin in una maniera calcio dipendente in vitro. Successivamente abbiamo dimostrato l’importanza di Tim-1 nel mediare tethering e rolling di cellule Th1 e Th17 sotto flusso in vitro: cellule mutanti, prive del dominio mucinico di Tim-1, esibiscono una forte riduzione nella capacità di tethering e rolling su P-selectin. Successivamente, per valutare l’importanza del legame Tim-1 - P-selectin anche in vivo abbiamo eseguito esperimenti di microscopia intravitale in venule mesenteriche murine attivate con trombina, ottenendo un modello d’infiammazione P-selectin dipendente. Anche in questo modello la mancanza del dominio mucinico di Tim-1 incide fortemente nella capacità di tethering e rolling di cellule Th1 e Th17. Successivamente abbiamo utilizzato un modello murino di CHS (contact hypersensitivity) per valutare un possible ruolo fisiologico del legame Tim-1 - P-selectin in vivo nel reclutamento leucocitario durante la risposta infiammatoria. La mancanza di Tim-1 in questo modello infiammatorio si traduce in una minor capacità migratoria di celluel T al sito d’infiammazione. Infine abbiamo dimostrato l’importanza di Tim-1 nel mediare reclutamento di cellue Th1 e Th17 nel sistema nervoso centrale. Esperimenti di microscopia intravitale nelle venule piali del cervello hanno dimostrato che cellule Th1 e Th17 prive del dominio mucinico di Tim-1 interagiscono meno con l’endotelio cerebrale infiammato. Le venule piali sono inoltre un punto d’accesso molto importante per le cellule T durante le fasi iniziali di sviluppo dell’encefalite sperimentale autoimmune; il modello murino di sclerosi muplitpla. Abbiamo quindi investigato il coinvolgimento di Tim-1 nello sviluppo di questo modello. La mancanza del dominio mucinico di Tim-1 risulta in uno sviluppo meno severo della patologia con livelli minori d’infiltrato pro-infiammatorio a livello del parenchima cerebrale. Collettivamente i nostri dati dimostrano che Tim-1 è un nuovo ligando per P-selectin con un ruolo specifico nel mediare il reclutamento leucocitario durante le risposte infiammatorie e l’induzione di patologie autoimmuni.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11562/712964
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