Urinary exosomal miRNAs in hypertension: methodological advancements and potential applications for biomarker discovery

Introduzione: Gli esosomi sono vescicole contenenti citoplasma rilasciate da molti tipi cellulari e che possono essere rinvenute in molti fluidi biologici, urine incluse. Gli esosomi urinari derivano dalle cellule epiteliali del tubulo renale e possono essere rilasciati da ogni segmento del nefrone. Gli esosomi urinari contengono constitutivamente RNA (piccoli RNA, microRNA ed mRNA) e possiedono un subset peculiare di proteine. I microRNA (microRNAs) sono piccole (20-22 nucleotidi) molecole di RNA endogeno non codificante che modulano l’espressione genica. I miRNA modulano meccanismi regolatori che influenzano processi cellulari fondamentali come la differenziazione, la proliferazione, la morte e il metabolismo cellulare e la fisiopatologia di molte malattie. Il potenziale dei miRNA come biomarcatori diagnostici è stato recentemente dimostrato in una grande varietà di patologie. Lo scopo della presente ricerca si è focalizzato in modo selettivo sul possibile ruolo dei miRNA nell’ipertensione umana, in particolare su una specifica forma di ipertensione secondaria, l’aldosteronismo primario (PA). PA è la causa principale di ipertensione arteriosa secondaria, con una prevalenza stimata che varia dal 10 al 15% nella popolazione afferente a centri di ipertensione specialistici. Una diagnosi corretta di PA richiede il campionamento venoso surrenalico (AVS) per la classificazione del sottotipo (adenoma secernente aldosterone, APA oppure iperplasia surrenalica bilaterale, BAH). Dal momento che questo tipo di test non è facilmente praticabile, è invasivo e richiede capacità specifiche dei radiologi interventisti, l’identificazione di biomarcatori appropriati e specialmente non invasivi per la definizione del sottotipo è altamente auspicabile. Questa necessità pratica è direttamente proporzionale alla crescente riscontro di pazienti affetti da PA. Per i suddetti motivi, la nostra ipotesi di lavoro è stata quella di identificare miRNA aventi una valenza diagnostica e/o prognostica negli esosomi urinari di pazienti con PA . Gli obiettivi di questo studio erano molti e possono essere riassunti come segue: i) definire il protocollo ottimale per isolare, purificare e validare gli esosomi dalle urine, ii) delineare il protocollo ottimale per una analisi su larga scala dei miRNA esosomiali, iii) analizzare i profili di espressione in sottogruppi di pazienti PA (APA e BAH) e con ipertensione essenziale (EH), e iv) studiare negli esosomi urinari l’abbondanza di alcune proteine note per essere associate ad un anomalo trasporto del sodio a livello del tubulo renale in corso di malattia.. Metodi: Gli esosomi urinari sono stati isolati usando tecniche di ultrafiltrazione, ultracentrifugazione ed il reagente ExoQuick-TC™. La caratterizzazione delle vescicole purificate è stata ottenuta attraverso analisi con “dynamic light scattering” per la determinazione della dimensione e con Western Immunoblotting per la determinazione del marcatore esosomiale Acquaporina 2 (AQP2). Allo scopo di ottimizzare il protocollo di purificazione dei miRNA dagli esosomi urinari, abbiamo paragonato i tre diversi metodi per l’isolamento degli esosomi urinari e le tecniche di estrazione dell’RNA. La resa, la dimensione e la qualità dell’ RNA esosomiale è stata valutata rispettivamente mediante colorante fluorescente, elettroforesi capillare e parametri spettrofotometrici. La valutazione della presenza e dell’abbondanza dei miRNA è stata ottenuta attraverso analisi con RT-qPCR. Lo studio dei profili di espressione dei miRNA da esosomi urinari è stato eseguito su un totale di 12 campioni (gruppo test: 4APA, 4BAH e 4 EH). I profili di espressione ottenuti con cartucce microfluidiche “TaqMan™ human Low density array (A&B)” sono stati valutati allo scopo di identificare diversi profili di miRNA. I miRNA con livelli di espressione significativamente diversi tra i vari gruppi sperimentali (APA,BAH ed EH) sono stati validati attraverso RT-qPCR. Gli array TaqMan™ hanno mostrato alcuni miRNA che risultavano espressi a livelli costanti, e che quindi potevano essere utilizzati come controlli endogeni per gli esosomi urinari. La predizione dei target dei miRNA è stata effettuata utilizzando diversi algoritmi computazionali (Target Scan, Pictar e miRandola). E’ stata inoltre valutata con Western Immunoblotting l’abbondanza relativa delle proteine NCC (cotrasportatore di cloruro di sodio) e prostasina, in pazienti affetti da PA. Risultati: Abbiamo confermato la natura esosomiale di tutte le frazioni di nanovescicole isolate utilizzando tutti e tre i metodi (Ultrafiltrazione, Ultracentrifugazione ed ExoQuick-TC™). L’ultrafiltrazione, d’altra parte, è risultata essere il metodo più consono per l’isolamento di esosomi urinari. La resa più alta di RNA esosomiale quantificata con il metodo di colorazione RiboGreen® è stata ottenuta utilizzando una combinazione dei metodi TRI Reagent™ e miRNeasy®, seguita da un secondo passaggio rispettivamente con TRI Reagent™, SeraMir™, miRCURY™, mirVana™ e miRNeasy®, e dopo analisi multivariata, il metodo SeraMir™ è risultato essere il migliore all’analisi quantitativa tramite RT-qPCR in termini di resa in miRNA, purezza ed accuratezza. E’ stata inoltre analizzata l’influenza delle condizioni di stoccaggio del campione, arrivando alla conclusione che l’abbondanza relativa in termini di miRNA non è penalizzata dalla conservazione. L’analisi di “profiling” dei miRNA attraverso TaqMan™ arrays ha portato al riscontro di 132 miRNA differenzialmente espressi negli esosomi urinari tra i due gruppi di ipertesi, PA (APA e BAH) ed EH. Dopo la successiva validazione, il miR-139-3p ed il miR-499-3p in APA, il miR-1179 ed il miR-141# in BAH sono stati identificati come potenziali biomarcatori. Il miRNA let-7c, invece, è stato riscontrato essere espresso in modo costante sia in tutti i gruppi analizzati sia nei controlli, suggerendo un suo potenziale ruolo come controllo endogeno.. Nei pazienti APA, il contenuto esosomiale di prostasina è stato trovato essere significativamente più alto rispetto ai campioni dei soggetti EH (P<0.05); inoltre si è osservata una drastica riduzione della quantità di prostasina esosomiale dopo intervento di surrenalectomia. Un elevato carico salino (nel contesto del test di conferma per la diagnosi di PA) si è rivelato influire sull’abbondanza di proteina NCC, causandone una significativa riduzione Conclusioni: La metodica di ultrafiltrazione combinata con l’uso delle colonne SeraMir™ exoRNA si è dimostrata essere la procedura ottimale per una rapida, economica ed efficiente purificazione dei miRNAs dagli esosomi urinari, utilizzabile per future applicazioni di ricerca nel campo dei miRNAsInoltre, le differenze nel profilo di espressione dei miRNAs fra le diverse patologie studiate, APA, BAH e EH, e il riscontro di miRNAs specifici per patologia (miR-139-3p e miR-499-3p in APA; miR-1179 and miR-141# in BAH) possono rappresentare dei potenziali biomarcatori in grado di permettere l’identificazione e la differenziazione di pazienti affetti da PA ed EH. Due proteine sono state identificate negli esosomi urinari, la prostasina, una proteasi associata all’attivazione del canale epiteliale del sodio (ENaC), e l’ NCC, ed entrambe rappresentano marcatori promettenti per futuri studi riguardanti il PA. Questo studio infine conferma il potenziale dell’analisi del profilo dei miRNAs come innovativo strumento diagnostico nel contesto dell’ipertensione secondaria, in grado di permettere l’identificazione dei sottogruppi di PA. Questa analisi non invasiva, basata sui miRNAs degli esosomi urinari, permetterebbe anche una migliore partecipazione dei pazienti allo screening, paragonata ad altre tecniche invasive (CT e AVS), sebbene l’analisi di gruppi più numerosi di soggetti sia necessaria per la conferma dei nostri risultati.

Background: Exosomes are cytoplasm containing vesicles released by many cell types that can be found in several biological fluids including urine. Urinary exosomes are derived from renal tubular epithelial cells and can be released from every segment of the nephron. Urinary exosomes constitutively contain RNA (small RNAs, microRNAs and mRNAs) and harbour unique subset of proteins. MicroRNAs (miRNAs) are endogenous short (20–22 nucleotides) non-coding RNA molecules that mediate gene expression. miRNAs modulated regulatory mechanisms influence fundamental cellular processes such as differentiation, proliferation, death, metabolism and pathophysiology of many diseases. The potential of miRNAs as diagnostic biomarkers has recently been shown in a broad variety of diseases. The focus of the present research was selectively centred on the possible role of miRNAs in human hypertension, particularly in a specific secondary form of hypertension i.e. Primary Aldosteronism (PA). PA is the major cause of secondary arterial hypertension with an estimated prevalence ranging from 10 to 15% in populations referred to specialist hypertension units. A correct diagnosis of PA requires adrenal venous sampling (AVS) for the classification of subtype (aldosterone producing adenoma, APA or bilateral adrenal hyperplasia, BAH). Since such testing is not easily suitable, is invasive and requires specialist skill of interventional radiologists; appropriate and especially non-invasive biomarkers for the definition of subtype are highly desirable. Such practical need is directly proportional to the growing frequency of patients recognized to be affected by PA. For all these reasons, our working hypothesis was to identify miRNAs in urinary exosomes of PA patients with diagnostic and/or pathogenetic value; in the present thesis are reported the results so far obtained. The objectives of the study were multiple, and in a progressive logical order may be summarized as follows: i) to establish the optimal protocol to isolate, purify and validate exosomes from urine, ii) to establish the optimal protocol for high throughput analysis of exosomal miRNAs, iii) to perform miRNA expression profiling in subgroups of PA patients (APA and BAH) and essential hypertension (EH), and iv) to analyze urinary exosomal abundance of some proteins previously reported to be associated with an abnormal sodium handling at renal tubular level in course of PA. Methods: Urinary exosomes were isolated using Ultrafiltration, Ultracentrifugation and ExoQuick-TC™ reagent. Characterization of the purified vesicles was done by dynamic light scattering analysis (DLS) for size determination and Western Immunoblotting to detect exosomal marker, aquaporin 2 (AQP2). To optimize the urinary exosomal miRNA purification protocol, we compared three different urinary exosomes isolation methods and six RNA extraction techniques. Exosomal RNA yield, size and quality were assessed respectively by specific staining with fluorescent dye, capillary electrophoresis and analysis of spectrophotometric parameters. MiRNAs detection and abundance was determined by RT-qPCR. Urinary exosomal miRNA profiling studies included a total of 12 test cohort samples (4 APA, 4 BAH and 4 EH). miRNA expression profiling using TaqMan™ human Low density array microfluidic cards (A&B) was performed to identify differential miRNA profiles. miRNAs with significant differences in expression between experimental groups (APA, BAH and EH) were validated by real-time quantitative reverse-transcription PCR. Validation cohorts included both hypertensive and healthy subjects (n=10). TaqMan™ arrays also identified some miRNAs that were expressed at constant levels, and hence can be used as urinary exosomal endogenous controls. miRNAs target prediction was carried out by Target Scan, Pictar and miRandola computational algorithms. We also examined urinary exosomal sodium chloride co-transporter (NCC) and Prostasin in patients with PA by western immunoblotting. Results: Urinary nanovesicles isolated using all the three methods (Ultrafiltration, Ultracentrifugation and ExoQuick-TC™), confirmed the purified fractions as exosomes. However, Ultrafiltration resulted to be the most suited method for urinary exosome isolation. The highest exosomal RNA yield quantified by RiboGreen® staining was obtained with the combination of TRI Reagent™ with miRNeasy®, followed by TRI Reagent™, SeraMir™, miRCURY™, mirVana™ and miRNeasy®; but after a multivariate analysis, SeraMir™ scored as the method of choice in terms of miRNA yield, purity and RT-qPCR miRNAs quantification accuracy. Storage conditions were also analyzed, showing that the relative abundance of urinary exosomal miRNAs is not influenced by urine freezing. TaqMan™ arrays miRNA profiling analysis revealed a total of 132 differentially expressed urinary exosomal miRNAs between PA (APA and BAH) and EH groups. On further validation, miR-139-3p and miR-499-3p in APA, miR-1179 and miR-141# in BAH were identified as potential biomarkers. Let-7c was constantly expressed in all tested groups and controls, suggesting its potential role as urinary exosomal endogenous control for miRNA studies. In APA patients, urinary exosomal content of Prostasin was significantly higher (P<0.05) than in EH patients and it drastically lowered after adrenalectomy. A high sodium load (in context of saline loading test) resulted in significant decrease in urinary exosomal NCC. Conclusions: Ultrafiltration in combination with SeraMir™ exoRNA columns resulted to be the optimal procedure for a rapid, cost-effective and efficient purification of miRNAs from urinary exosomes which can be perfectly suited for further applicative research in the field of miRNAs research. Urinary exosome samples can be used for the analysis of miRNA expression in PA. Though, miRNA expression profiles differ between APA, BAH and EH groups, pathology specific miRNAs (miR-139-3p and miR-499-3p in APA; miR-1179 and miR-141# in BAH) may serve as potential biomarkers for identifying and differentiating subgroups of PA and EH patients. Urinary exosomal Prostasin, a protease associated with ENaC activation, and NCC are promising markers for future PA research. This study also confirms the power of miRNA profiling as a novel diagnostic tool for the diagnosis of secondary forms of hypertension and can assist in separating subgroups of PA. Such non-invasive urinary exosomal-based miRNA assays could provide better screening compliance as compared to invasive screening methods (CT and AVS) but larger cohorts are needed to further confirm our preliminary results.