NMR Interaction studies of Human Liver Fatty Acid Binding Protein with putative ligands and associated proteins

Le molecole lipidiche, come acidi grassi, eicosanoidi e acidi biliari (BAs) sono essenziali per la sopravvivenza cellulare, in quanto possono fungere da fonti di energia, da substrati per la formazione di membrane oppure da molecole segnale per la regolazione del metabolismo cellulare. A causa della loro scarsa solubilità e della loro potenziale citotossicità necessitano di chaperon intracellulari che, legandole, aumentano la loro solubilità in solventi acquosi. Le proteine che legano gli acidi grassi, FABPs (Fatty Acid Binding Proteins), appartengono alla famiglia delle iLBPs (intracellular lipid binding proteins), una classe di piccole proteine citoplasmatiche (di circa 14-15KDa) evolutivamente correlate fra loro, probabilmente implicate nel trasporto lipidico trans-cellulare. Le iLBP sono proteine versatili che partecipano ai processi nucleari e al mantenimento dell’omeostasi e del metabolismo lipidico; per questo motivo sono state scelte come bersagli di farmaci contro lo sviluppo di dislipidemie. La FABP di fegato (LFABP), appartenente alla sotto-famiglia II delle FABP, è forse la più peculiare; a differenza degli altri membri può infatti accomodare, nella sua cavità idrofobica, due molecole di acidi grassi a lunga catena, ma anche una grande varietà di molecole idrofobiche come gli esteri dell’acil-CoA, fosfolipidi e acidi biliari. Per le sue particolari caratteristiche e l'alta concentrazione che può raggiungere all'interno degli epatociti (1-5% delle proteine solubili totali), si è ipotizzato che la LFABP umana (HLFABP) sia implicata nello sviluppo dei parassiti malarici, durante la fase epatica della malattia. Questa fase è asintomatica e potrebbe fornire nuove strategie per arrestare l'infezione. UIS3 è una piccola proteina trans-membrana, presumibilmente localizzata nella membrana vacuolare parassitofora (PVM), specificamente espressa negli sporozoiti infettivi ed essenziale per il loro sviluppo nella fase iniziale della malaria all’interno del fegato. Un saggio di tipo yeast two hybrid, basato sulla proteina UIS3 derivante dal parassita malarico dei roditori P. yoelii (Py-UIS3), ha permesso di identificare LFABP come possibile partner di interazione. Inoltre, in un lavoro del 2008 di Ashwani e collaboratori, venne riportata un’interazione diretta fra HLFABP e il dominio solubile di UIS3 di Plasmodium falciparum ( PfUIS3(130-229)). Al fine di ottenere informazioni vincolanti ad un livello atomico di risoluzione, l'interazione tra HLFABP e PfUIS3(130-229) è stata analizzata in dettaglio tramite spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare(NMR). Inoltre, anche l'associazione con fosfolipidi e acidi grassi è stata analizzata attraverso NMR. I nostri dati, tuttavia, non hanno evidenziato alcuna interazione di PfUIS3(130-229) con HLFABP e/o molecole lipidiche, indicando la necessità di ridefinire il modello attuale di importo di lipidi nei parassiti malarici mediato da LFABP. Nella seconda parte di questo progetto di ricerca è stata analizzata in dettaglio l’interazione fra HLFABP e gli acidi grassi. L’NMR e la spettroscopia di massa (MS) sono state utilizzate per la prima volta insieme per caratterizzare questa associazione. Campioni di HLFABP in complesso con oleato (OA) e palmitato (PA) sono stati preparati in acqua e successivamente analizzati utilizzando la tecnologia ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) per determinarne la specificità, la stechiometria e l'affinità relativa. I nostri dati sono concordi con la presenza di due siti di legame distinti con una diversa affinità per gli acidi grassi. Sono poi stati allestiti degli esperimenti di competizione, titolando la proteina sia con OA che con PA; i campioni sono stati analizzati tramite ESI-MS ed i dati indicano che OA e PA competono effettivamente per lo stesso sito di associazione all'interno della proteina e che HLFABP ha una maggiore affinità per gli acidi grassi instauri. Successivamente abbiamo sfruttato la potenza delle titolazioni 13C-NMR per indagare sia l'interazione fra HLFABP e acidi grassi marcati in 13C, che lo stato di ionizzazione dei ligandi legati nella tasca idrofobica della proteina. A livello globale, abbiamo sviluppato un metodo adatto per lo studio di altri membri della famiglia FABP, che, nonostante le loro dimensioni molto favorevoli, sono sistemi complessi per essere caratterizzati da una singola tecnica biofisica. Inoltre, questo metodo potrà essere applicato anche per lo studio di HLFABP in complesso con altri ligandi idrofobici. Nell'ultima parte di questo lavoro ci siamo concentrati sull'interazione tra HLFABP e gli acidi biliari, molecole anfipatiche, che facilitano l'assorbimento dei lipidi, del colesterolo e di vitamine liposolubili nell'intestino tenue. Gli acidi biliari subiscono un riciclaggio tra l'intestino ed il fegato, chiamato "Circolazione enteroepatica", che consente il recupero di quasi il 95% di queste preziose molecole. Dal momento che un trasportatore di acidi biliari non è stato ancora stato identificato negli epatociti dei mammiferi, abbiamo esplorato l’associazione tra HLFABP e gli acidi biliari utilizzando una vasta gamma di tecniche biofisiche, coinvolgendo l'NMR, la spettroscopia di fluorescenza e la spettrometria di massa. L'interazione tra HLFABP e l’acido glicocolico (GCA), il sale biliare più abbondante presente nel fegato umano, è stato ampiamente esplorato mediante NMR. L’NMR è una fra le spettroscopie più potenti e versatili per l'analisi molecolare, poiché permette di caratterizzare la struttura delle macromolecole biologiche ed i loro complessi ad un livello atomico di risoluzione. Inoltre, l'NMR fornisce informazioni sulla dinamica proteica su una vasta gamma di scale dei tempi . Le dinamiche possono influenzare la velocità e la via di ripiegamento delle proteine, così come l’aggregazione, la catalisi e l’associazione ad un ligando attraverso l’adattamento indotto o la selezione conformazionale. Così, la determinazione delle dinamiche proteiche in soluzione è importante per comprendere l'intero spettro di funzioni macromolecolari svolte dalle proteine. Esperimenti di titolazione NMR ed esperimenti omonucleari 1H-1H NOESY, eseguiti con diversi schemi di marcatura isotopica, suggeriscono che HLFABP è in grado di legare una sola molecola di GCA. Inoltre, per complementare i dati NMR, è stata eseguita un’analisi computazionale per calcolare la struttura del complesso, utilizzando il programma di docking HADDOCK. Successivamente, per meglio definire il legame, sono stati acquisiti esperimenti di rilassamento 15N sul backbone di HLFABP nella sua forma apo ed in complesso sia con GCA che con OA e sono state ottenute dinamiche residuo-specifiche su una vasta scala di tempi, che va dai ns ai ms. I nostri dati indicano chiaramente chele dinamiche veloci (ps-ns) non vengono influenzate particolarmente dal binding, mentre le dinamiche lente (μs-ms) sono mantenute o accentuate dopo il legame. Infine sono stati eseguiti esperimenti di scambio idrogeno/deuterio e CLEANEX per monitorare le zone più protette della proteina dallo scambio col solvente in presenza ed in assenza dei ligandi. In presenza di GCA è stato poi osservato un aumento della stabilità proteica. La spettroscopia di fluorescenza e l'NMR sono state anche utilizzate per caratterizzare l'interazione fra HLFABP e un pool di acidi biliari con diverse modalità di coniugazione e idrossilazione. I dati NMR mostrano che HLFABP può interagire con un’ampia gamma di acidi biliari in modo complesso, attraverso la formazione di almeno uno stato attivato. In aggiunta, i nostri dati NMR suggeriscono che la struttura della proteina sia preformata per il legame delle diverse molecole idrofobiche. Infatti la rete di legami idrogeno non viene perturbata in modo significativo dall'aggiunta dei vari ligandi. Attraverso la spettroscopia NMR abbiamo poi dimostrato che HLFABP esiste come un insieme di conformeri in scambio veloce fra loro su una scala di tempi NMR. La spettroscopia di fluorescenza è stata impiegata per calcolare l’affinità di HLFABP verso i vari acidi biliari utilizzati nello screening e attraverso un saggio di competizione, utilizzando il DAUDA come composto fluorescente, è stata calcolata un’affinità μM (da 0.6-7.5 μM) in accordo con quella calcolata tramite spettroscopia NMR. L’affinità maggiore è stata ottenuta per quegli acidi biliari con caratteristiche di idrofobicità maggiori. Infine, la presenza di complessi eterotipici, formati da HLFABP in complesso sia con acidi biliari che con acidi grassi, è stata analizzata tramite NMR e ESI-MS.

Lipidic molecules such as fatty acids (FAs), eicosanoids and bile salts (BAs) are essential for cell survival because they serve as metabolic energy sources, substrates for membranes and signaling molecules for metabolic regulation. Due to their low solubility and in some case cytotoxicity they necessitate intracellular chaperons, which bind them, thus increasing their aqueous solubility. Fatty acid binding proteins (FABPs), belong to the Intracellular lipid binding proteins (iLBPs) family, a class of evolutionarily related small (14-15 KDa) cytoplasmic proteins, which have been proposed to be implicated in the transcellular transport of lipophilic ligands. Due to their participation in nuclear processes and lipid metabolism and homeostasis, they have recently been proposed as drug targets against the development of lipid related disorders. Among the other family members, liver fatty acid binding protein (LFABP), belonging to subfamily II of FABPs, is the most unique. Differently from the other FABPs, LFABP is able to accommodate two long chain FAs (LCFAs) molecules, but also a wide range of hydrophobic ligands, such as BAs, eicosanoids, Acyl-CoA esters and phospholipids. Due to its peculiar characteristics and the high concentration that it could reach within the hepatocytes (1-5% of total soluble proteins), human LFABP (HLFABP) has been hypothesized to be implicated in malaria parasites development, during the hepatic stage of the disease. The hepatic stage is asymptomatic and it would provide novel strategies for arresting the infection. UIS3 is a small transmembrane protein, presumably localized to the parasitophorous vacuolar membrane (PVM), specifically expressed in infective sporozoites, and essential for early-stage liver development. A yeast two-hybrid screen based on UIS3 of the rodent malaria parasite P. yoelii (Py-UIS3) identified mouse LFABP as an interacting host protein. In addition, a work of 2008 of Ashwani and collaborators reports a direct interaction between HLFABP and the soluble domain of UIS3 from Plasmodium falciparum (PfUIS3(130-229)). In order to gain binding information at an atomic level of resolution, the interaction between HLFABP and PfUIS3(130-229) was analyzed in detail exploiting Nuclear Mgnetic Resonance (NMR) spectroscopy. Furthermore, the direct binding of phospholipids and FAs to UIS3 was also analyzed by NMR. However, our data did not show any interaction of PfUIS3(130-229) with HLFABP and lipid molecules, calling for a redefinition of the current model of FABP-mediated lipid import by human malaria parasites. In the second part of this research project, we investigated in detail the interaction between HLFABP and fatty acids. For the first time NMR and MS spectroscopy were used in combination to characterize the binding between HLFABP and FAs. Samples of HLFABP in complex with palmitate (PA) or oleate (OA) were prepared in water and analyzed through Electron Spray Ionization mass spectroscopy (ESI-MS) to asses specificity, stoichiometry and relative affinity. Our data are in agreement with the presence of two distinct binding sites with different affinities for FAs. Competition experiments were also performed, titrating the protein with both PA and OA; OA and PA effectively compete for the same binding site within the protein binding pocket. Our results show that HLFABP has an higher affinity for unsaturated FAs. Successively, we exploited the power of 13C NMR titration data to investigate the interaction between HLFABP and 13C FAs and to get information about the ionization state of the bound ligands. Globally, we developed a method suitable for the study of other FABP family members, which, despite their favorable size are really challenging systems to be characterized by only a singular biophysical technique. In addition, this method could be also applied to the study of HLFABP in complex with other hydrophobic ligands. In the last part of this work we focused on the interaction between HLFABP and BAs, amphipathic molecules, which in the small intestine facilitate the absorption of dietary lipids, cholesterol, and fatsoluble vitamins. BAs undergo a recycling pathway between the intestine and the liver, called “enterohepatic circulation”, which allows the recovery of almost the 95% of these precious molecules. Since a BA carrier within the hepatocytes has not been identified yet, we explored the interaction between HLFABP and BAs using a wide range of biophysical techniques, involving NMR, florescence and mass spectroscopy. The interaction between HLFABP and glycocholic acid (GCA), the most abundant bile salt present in human liver, was extensively explored using NMR spectroscopy technique. NMR is one of the most powerful and versatile spectroscopic technique for molecular analysis, since it allows to characterize biological macromolecules and their complexes at an atomic level of resolution. In addition, NMR provides information about protein dynamics on a wide range of time scales. Dynamics can affect the rate and pathway of protein folding, as well as misfolding and aggregation, catalysis and also binding via induced fit or conformational selection. Thus, the determination of protein dynamics in solution is important for realizing the full spectrum of macromolecular functions and for predicting and engineering protein behavior. NMR titration experiments and 1H-1H homonuclear NOESY filtered experiments, performed with different labeling schemes, suggested that HLFABP is able to accommodate only one molecule of GCA. To complement NMR data, a model of the complex was obtained through a computational analysis, using the docking program HADDOCK. To better characterize the binding, 15N backbone relaxation experiments on HLFABP in its apo form and in complex with either GCA or OA were recorded and residue specific dynamics, on a time scale ranging from ps to ms, were obtained. Fast time scale dynamics are not significantly perturbed upon OA/GCA addition, while slow motions are retained or enhanced upon binding. Hydrogen/deuterium exchange and CLEANEX experiments were also performed to get information on solvent accessibility to individual sites and to detect protein dynamics occurring on a much slower time scale. An increase in protein stability upon GCA/OA binding was observed. For the first time NMR and fluorescence spectroscopy were combined on a BA pool, with different pattern of conjugation and hydroxylation. The NMR data show that HLFABP can interact with a wide range of bile salts, through a complex pathway, involving at least one activated state. In addition the hydrogen bond network was not significantly perturbed upon ligand addition, indicating that the scaffold of the protein is preformed to bind such kind of ligands. Through NMR spectroscopy, we demonstrated also that HLFABP exists as an ensemble of conformers in fast exchange on an NMR time scale. Fluorescence spectroscopy was used to calculate the affinity of HLFABP toward the different BAs employed in the study. An affinity in the µM range (spanning form 0.6-7.5µM) was obtained through DAUDA displacement assay, in close agreement with the ones calculated by NMR. The higher affinity was obtained for those BAs displaying high hydrophobic properties. Finally we analyzed both by NMR and mass spectroscopy the existence of an heterotypic complex constituted by HLFABP in complex with both GCA and FAs, which is likely the conformation assumed by the protein in vivo.