URINARY PROTEOMIC ANALYSIS IN HEALTHY SUBJECTS AND HYPERTENSIVE PATIENTS:APPLICATIONS FOR BIOMARKER DISCOVERY

Molti studi recenti hanno utilizzato tecniche di proteomica urinaria nel campo della “biomarkers discovery”. Le urine umane rappresentano uno dei fluidi biologici più interessanti, dove l’analisi proteomica può essere d’aiuto per l’identificazione dell’espressione differenziale in pazienti allo scopo di effettuare una diagnosi precoce o per migliorare il risultato terapeutico. Inoltre, la proteomica urinaria, rispetto a quella sierica, si è focalizzata principalmente sulla scoperta di biomarcatori dal momento che il campione biologico urinario è per sua natura più semplice, meno ricco di proteine abbondanti e di proteasi. Studi recenti hanno dimostrato che le proteine urinarie sono altamente stabili dopo cicli di congelamento e scongelamento e che la lunghezza delle procedure di processamento a temperatura ambiente non inficia il proteoma urinario. Inoltre, l’analisi proteomica nel campo renale si è principalmente occupata dell’identificazione e del rilevamento di proteine urinarie che cambiano in condizioni patologiche od infiammatorie. L’isolamento degli esosomi può contribuire alla dimuzione della complessità del proteoma allo scopo di identificare proteine meno abbondanti ma di rilevanza clinica. In questa tesi l’analisi proteomica urinaria è stata applicata con successo all’identificazione di nuovi biomarcatori proteici in campioni di urine e di esosomi urinari. Un approccio proteomico “tradizionale” è stato utilizzato per lo studio dei cambiamenti nelle proteine urinarie correlate all’ipertensione (ed in particolare all’iperaldosteronismo primitivo, PA) ed al ciclo ormonale nelle donne. Numerosi campioni di urine provenienti da controlli sani e pazienti con malattie ipertensive sono stati raccolti per l’analisi proteomica comparativa. Queste analisi hanno consentito di identificare un putativo biomarcatore, l’inibitore delle serin proteasi serpina b3, che è stato ulteriormente studiato utilizzando altre metodiche (studi di espressione, ELISA, western immunoblotting, immunoistochimica, etc.) in un gruppo di campioni allargato. Inoltre, campioni di urine e tessuto provenienti da pazienti con diversi sottotipi di aldosteronismo primitivo (APA, adenoma secernente aldosterone, e BAH, iperplasia bilaterale) sono stati utilizzati per la valutazione della presenza di serpina b3. I dati ottenuti da tutti questi campioni suggeriscono un ruolo dell’aldosterone nella modulazione della serpina b3, fornendo nuovi spunti per la comprensione dei meccanismi coinvolti nell’aldosteronismo primitivo. Abbiamo inoltre applicato con successo un metodo per l’isolamento di esosomi urinari (attraverso un concentratore a membrana) con lo scopo di isolare proteine ed RNA esosomiale per rilevare la presenza di potenziali biomarcatori come la serpina b3. Questo protocollo è stato validato attraverso esperimenti di microscopia elettronica e western blot analisi mediante anticorpi diretti contro il marcatore specifico acquaporina 2. Inoltre, il comportamento di serpina b3, di acquaporina 2 e di altri componenti legati al bilancio di sodio ed acqua nell’organismo, sono stati studiati attraverso un esperimento di “ritmo circadiano” in 6 soggetti sani. Globalmente i dati mostrati in questa tesi confermano l’utilità di questo approccio per l’uso dell’analisi proteomica nel campo della ricerca di biomarcatori di potenziale utilità clinica.

Several recent studies have implemented urinary proteomic approach for biomarker discovery. Human urine is one of the most interesting fluids, where proteomic analysis helps to identify differential expression of proteins in patients for early disease detection for better therapeutic outcome. Interestingly, urinary proteomics has focused more attention for the biomarker discovery than serum proteomics, because of the limited protein content, simpler composition, and low abundance of protease concentration. Recent studies demonstrated that proteins in the urine are highly stable after repeated freeze and thaw cycles, and the length of sample handling at room temperature does not affect the urine proteome. Proteomics analysis in the renal field has been mainly focused on the detection and identification of urinary proteins that change in pathologic or inflammatory conditions. Exosome isolation helps to reduce the complexity of the proteome to discover less abundant proteins but clinically relevant. In this thesis urinary proteomic analysis was successfully applied for the identification of novel protein biomarkers from urine and urinary exosomes. A “traditional” proteomic approach was applied to the study of the changes in urinary proteins related to hypertension (and in particular primary aldosteronism, PA) and hormonal cycle in women. Several urine samples from healthy controls and patients with hypertensive diseases were collected for the comparative proteomics analysis. After these analyses a “putative” biomarker was identified, the serine protease inhibitor serpin B3 (SB3), and further studied by means of different methodologies (ELISA, western immunoblotting, immunohistochemistry, Real Time PCR etc.), in a bigger set of samples. Additionally urine and tissue samples were obtained from primary aldosteronism subtype (aldosterone-producing adenoma, APA, and bilateral adrenal hyperplasia, BAH) patients for the detection of serpin B3. Interestingly the data obtained from these samples suggest a role of aldosterone in the modulation of serpin B3, giving new insights for the understanding of the mechanisms involved in primary aldosteronism. We successfully applied a method for urinary exosomes isolation (by nanomembrane concentrator application) with the aim of isolating exosomal protein and RNA for the detection of potential biomarkers such as prostasin and serpin B3. Exosomes isolation protocol was confirmed by electron microscopy as well as the presence of urinary exosome specific marker protein aquaporin 2. Additionally, the behavior of such protein was investigated, together with other components related to Na-water balance, in a “circadian rhythm” study on 6 healthy subjects. Taken all together, these data point toward the possible application of such approach to the use of proteomics approach as valuable tool for biomarker discovery and analysis, with a potential clinical usefulness.