NMR Structural and interaction studies of bile acid binding proteinscomplexed with physiological ligands and bile acid-derived contrastagents

Il progetto svolto durante il mio Dottorato di Ricerca riguarda essenzialmente la cartterizzazione strutturale di complessi proteinalegante tramite spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). Studiare le interazioni proteiche a livello molecolare è di fondamentale importanza per acquisire informazioni su molti processi biologici, quali lo sviluppo di malattie nell’uomo o il relativo disegno di farmaci. La Risonanza Magnetica Nucleare è una tecnica particolarmente adatta per la caratterizzazione, a livello atomico, delle interazioni tra proteine e altre molecole in soluzione. La Risonanza Magnetica Nucleare può essere utilizzata per valutare gli aspetti strutturali, termodinamici e cinetici di una reazione di interazione proteina-legante e può rilevare anche le interazioni più deboli. In questo contesto, durante il mio Dottorato di Ricerca ho affrontato l'indagine strutturale e lo studio dei determinanti molecolari dell’interazione di differenti proteine, le bile acid binding proteins (BABPs) in complesso sia con i loro leganti fisiologici sia legate a farmaci sintetitici. Le BABPs sono piccole proteine citosoliche che svolgono la loro funzione negli epatociti ed enterociti, dove agiscono come trasportatori intracellulari degli acidi biliari, permettendo il loro ricircolo tramite la circolazione enteroepatica. Nella prima prima parte di questa tesi viene descritta la determinazione strutturale tramite NMR della BABP di fegato di pollo (cL-BABP) in complesso con l’addotto acido biliare-Gd-DTPA, un potenziale agente di contrasto epatospecifo per la Risonanza Magnetica per Immagine (MRI). Il razionale di questo studio deriva da una ricerca di nuovi agenti di contrasto epatospecifici per la discriminazione e la diagnosi di lesioni focali o tumori nel fegato, tramite la Risonanza Magnetica per Immagine. La seconda parte di questa tesi è focalizzata sulla caratterizzazione delle interazioni della BABP ileale di pollo (cI-BABP) con acidi biliari. Questo studio è stato svolto utilizzando diversi approcci, così come la spettroscopia NMR e misure calorimetriche. La terza parte del mio lavoro di tesi si basa sulla determinazione strutturale tramite NMR del complesso ternario tra la CI-BABP e due molecole di acido glicochenodeossicolico (GCDA). Infine, un singolo e doppio mutante della proteina CI-BABP (A101S e H99Q/A101S) sono stati prodotti per studiare i determinanti molecolari della cooperatività di legame. I dati ottenuti permettono di capire le basi chimiche del trasporto intracellulare degli acidi biliari. Questa conoscenza può aprire nuove vie per l'esplorazione di strategie di prevenzione e trattamento delle malattie metaboliche.

The research project of my PhD concerns essentially the Nuclear Magnetic Resonance (NMR) structural studies of protein-ligand complexes. Studying protein interactions at the molecular level is crucial to the understanding of many biological processes, such as human diseases and drug design. NMR spectroscopy is particularly well suited to the investigation, at the atomic level, of the interactions between proteins and other molecules in solution. NMR can be used to evaluate the structural, thermodynamic and kinetic aspects of a binding reaction, even for weak protein-ligand interactions. In this contest, during my PhD I addressed the structural investigation and the study of the molecular determinants of binding of different bile acid binding proteins (BABPs) and their native ligands or synthetic drugs. BABPs are small cytosolic proteins that display their function in the hepatocytes and enterocytes where they act as bile acids transporters participating to the enterohepatic circulation. The first part of this thesis is related to the structural determination of chicken liver-BABP (cL-BABP) in complex with a bile acid-based gadolinium(III)-chelate, a potential hepatospecific contrast agent for magnetic resonance imaging (MRI). The rationale of this study derived from a search for new hepatospecific MRI contrast agents for the discrimination and diagnosis of focal lesions or hepatic malignancies. The second part of this thesis is focused on the characterization of the interactions of chicken ileal BABP (cI-BABP) with bile acids. This study has been performed using different approaches, such as NMR spectroscopy and calorimetric measurements. The third part of the my thesis work is based on the NMR structural determination of the ternary complex between cI-BABP and two molecules of glycochenodeoxycholic acid (GCDA). Finally, a single and double mutant of cI-BABP (A101S and H99Q/A101S) were produced to investigate the molecular determinants of binding cooperativity. The obtained data allow shedding light on the chemical basis of intracellular bile acid transport. This notion may open new avenues for exploration of strategies for prevention and treatment of metabolic diseases.